T型钙通道在局麻药神经细胞毒性损伤中的作用研究

局麻药（Local Anesthetics,LA）的神经毒性损伤已引起人们的广泛关注，低电压依赖性钙通道(T型钙通道)因在静息电位下可激活，是调节细胞生理及病理活动的重要启动子（pacemaker）。已有的研究证实，T型钙通道参与了背根神经节压迫痛大鼠及糖尿病痛大鼠的神经损伤。我们推测LA致神经细胞损伤时，钙离子通过T型钙通道进入细胞内，一方面激活各种钙依赖性蛋白酶，兴奋性氨基酸释放增加，诱发调亡；另一方面激活细胞内钙储存系统，触发钙释放激活钙离子通道，细胞内钙库释放大量钙离子，形成钙超载并导致细胞损伤。本项目拟通过细胞培养及整体动物LA神经损伤模型，通过电生理技术、RNAi技术、免疫印迹、定量PCR、流式细胞技术等方法观察LA神经损伤时T型钙电流、T型钙通道的表达、细胞凋亡、细胞活力及细胞内钙离子浓度变化，探讨T型钙通道在LA神经损伤中的作用，为临床上LA神经损伤的防治提供依据。

局麻药的神经毒性反应已经引起人们的密切关注。T型钙通道，即低电压依赖性钙通道，可在静息下激活，是调节神经元活动的重要启动子，参与了神经损伤所致慢性神经病理性疼痛。T型钙通道在局麻药的神经损伤中有何作用尚不清楚。本项目采用离体细胞培养的方法，通过WB和real-time PCR等方法，发现SH-SY5Y细胞含有T型钙通道的三种亚型（Cav3.1，Cav3.2和Cav3.3），但以Cav3.1的表达最多。利多卡因处理后，SH-SY5Y细胞活力降低，细胞LDH释放增加，细胞凋亡率升高，Caspase-3表达增加。T型钙通道阻滞剂米贝地尔能减轻利多卡因所致的SH-SY5Y细胞损伤。通过RNAi的方法，成功构建了特异性的抑制Cav3.1表达的pshRNA -CACNA1G -SH-SY5Y细胞株。盐酸利多卡因对pshRNA -CACNA1G -SH-SY5Y细胞株的神经毒性损伤明显小于Cav3.1正常表达的的SH-SY5Y细胞。采用鞘内给药的方法，建立了鞘内注射盐酸利多卡因所致的大鼠脊髓神经毒性损伤模型，观察了Cav3.2 T型钙通道在大鼠盐酸利多卡因脊髓神经毒性损伤中的作用。结果表明，Cav3.2T型钙通道参与了盐酸利多卡因所致的大鼠脊髓神经毒性损伤。