DFAT细胞为模型研究NCOR1在牛脂肪细胞增殖分化和葡萄糖摄取中作用及机制

The fat deposition of bovine is closely related to the adipose cell proliferation, differentiation and glucose uptake. However, the mechanism of bovine fat deposition regulation is undefined. The expected goal of our research is to establish uniform cell model (DFAT) via dedifferentiating mature fat cells, from a new perspective, which more refined research and reflect regulation of adipogenesis. Based on the DFAT model, analyze the proliferation and differentiation differences of preadipocytes from different parts of cattle body and to explore the corresponding molecular mechanisms. Meanwhile, we are also planning to reveal the discipline of bovine preadipocytes proliferation,differentiation and the glucose uptake regulated by NCOR1, at mRNA level and protein level. Future more, find out its potential signal pathways via phosphorylation detection,Co-Immunoprecipitation and inhibitor blockage experiments. The final purpose of our project is laid the foundation of to clarify the mechanism of bovine adipogenesis. Otherwise, provide theoretical basis to breeding new beef cattle breeds of low subcutaneous fat but high intramuscular fat.

牛体内脂肪沉积与脂肪细胞的增殖分化和葡萄糖摄取密切相关。然而，目前关于牛脂肪沉积相关分子机理尚不明确。本项目拟建立由牛成熟脂肪细胞去分化得到的高度均一的前体脂肪细胞（DFAT）为模型，从新的角度，更精细地研究并揭示牛脂肪形成机制。基于DFAT模型，比较皮下和肌内脂肪来源的牛DFAT细胞增殖分化能力差异并找出相关基因时序表达规律；通过腺病毒载体上调、下调NCOR1基因表达，从mRNA、蛋白水平分析牛DFAT细胞分化相关基因变化规律和葡萄糖摄取量变化，并进一步通过免疫共沉淀、蛋白磷酸化检测以及蛋白酶抑制剂阻断实验等方法探究NCOR1是否通过PPARγ和胰岛素相关通路作用，并初步阐明相应的作用机制。上述研究结果将为进一步阐明牛脂肪形成机制奠定一定基础，并为今后培育低体脂、高肌内脂肪肉牛功能基因育种提供一定的理论依据。

核受体辅抑制子（NCOR1）属于类固醇激素-视黄酸受体相关辅抑制子家族，经与其它配体结合形成转录复合物，通过介导染色体紧缩、组蛋白乙酰化以及直接互作等多种方式调控基因表达，从而在机体的生长发育、细胞分化等体内许多生理过程中发挥作用。然而，NCOR1基因在牛脂肪细胞分化及脂代谢中功能未知。. 本研究首先完成了NCOR1基因时空表达谱，其在牛睾丸、瘤胃、小肠组织中高丰度表达，在腹脂、脾、肾、肺、皮脂等组织中等丰度表达。在不同月龄发育阶段牛及不同分化时间的牛前体脂肪细胞中呈现先升高后降低的趋势。通过双荧光素酶报告系统我们筛选获得了NCOR1基因核心启动子区（-279到-79），并进一步筛选获得了PAX6、AP2、EST1、SMAD等作为上游转录因子对NCOR1基因的表达发挥重要作用，且发现位于核心启动子区CpG岛介导的甲基化修饰可能参与了NCOR1基因转录调控。根据NCOR1基因序列设计并包装获得shRNA-NCOR1腺病毒。qPCR及Western-blot结果表明，shRNA2能显著下调NCOR1表达（90%）。进一步通过腺病毒侵染牛SVF细胞结果表明，NCOR1的下调能明显提高牛前体脂肪细胞分化和脂滴积累。qPCR结果表明，NCOR1基因的下调，显著上调了FABP4、LPL、SREBP1的基因的表达（P<0.01），而对FASN、PPARγ基因没有明显的调控作用，表明NCOR1通过调节脂肪分化后期脂肪酸代谢相关基因进而影响成脂分化及脂滴形成。. 上述工作为今后进一步通过组学EMSA、CHIP等方法揭示并构建NCOR1基因在影响牛成脂分化中的下游互作网络，解析核心启动子区上游相关转录因子及甲基化修饰在NCOR1转录调控中作用及对牛成脂分化影响等研究奠定了基础。