羊肚菌属真菌交配基因及信息素受体基因结构组成和表达机制研究

Morchella fungi are well-known and economically important edible mushroom, but it is difficult to artificially cultivate in large-scale for their complex genetic background and ambiguous mating mechanism. There are many nuclei in the mycelia and ascospores , which makes it hard to distinguish between homokaryon and heterokaryon in the single spore isolates. In this plane, the complete gene sequences of mating factor MAT1-1,MAT1-2 and pheromone receptor a,alpha in five species of Morchella genus will be obtained by DNA Walking based on the conserved segments from the transcriptome sequences of M.rufobrunnea in the previous study. The homokaryon and heterokaryon can be distinguished by amplified these four gene segments as the molecular marker in the single spore isolates of other three species. The expression leve of the genes of mating factor and pheromone receptor in the mating strains were determined by the method of fluorescence in situ hybridization in order to analyze whether they were selective expressed in mating , combined with observation of the nuclei change in the process of ascus development for exploring the mating mechanism in the molecular level and laying the foundation for the artificial cultivation of the Morchella in large-scale.

羊肚菌是一种具有很高经济价值的美味食用菌，但它的遗传背景较为复杂，菌丝和子囊孢子都为多核体，很难从单孢分离物中区分同核体和异核体，交配机制也不明确，这些都给规模化人工栽培带来较大难题。本项目利用前期工作中获得的红褐羊肚菌(Morchella rufobrunnea)转录组序列信息设计引物，DNA walking全长克隆羊肚菌三大类群中五个种的交配基因MAT1-1、MAT1-2和信息素a因子、alpha因子受体基因，以这四个基因为分子标记，把其中三个种中得到的单孢分离群体划分为同核体和异核体；区分后的同核体、异核体之间两两对峙培养，荧光原位杂交检测对峙拮抗菌丝中交配基因和信息素受体基因的表达情况，分析它们是否在交配时选择性表达，再结合子囊发育过程中核相变化的显微观察，从分子水平上探索羊肚菌的交配机制，为羊肚菌规模化人工栽培奠定坚实基础。

羊肚菌属真菌是具有较高理论研究和应用价值的珍稀食用菌，其系统发育种分为黑色、黄色和棕色类群，虽然黑色类群的3个物种在中国规模化栽培，但其交配类型和生活史等遗传背景知识仍不明确。本项目基于Morchella importuna的基因组测序，明确了黑色种M. importuna的交配位点信息，并根据其侧翼序列设计引物，长片段PCR扩增和测序获得了黄色类群种Mes-20的完整交配位点，比较发现这两个种的交配位点idiomorph除长度不同外，在MAT1-1 idiomorph的结构上也有较大差异；M. importuna的MAT1-1 idiomorph长10.5kb,包含了三个基因MAT1-1-1、MAT1-1-10和MAT1-1-11，而Mes-20的MAT1-1 idiomorph长7.8kb，包含MAT1-1-1和MAT1-1-10基因，没有MAT1-1-11；MAT1-1-10和MAT1-1-11是经本项目研究发现和命名的。在此基础上，设计多对特异引物，分别克隆了羊肚菌属7个黑色种、9个黄色种和1个棕色种的MAT1-1-1和MAT1-2-1基因，并分析了它们的序列结构特征：两个交配基因的DNA序列在黑色和黄色类群内有较高保守性，9个黄色种之间相似性大于90%，7个黑色种之间相似性大于85%，然而在黄色和黑色类群的种之间只有60%左右的相似性。以交配型基因片段为分子标记，检测了黑色种M. importuna、M. sextelata 、M. purpurascens和黄色种Mes-6、Mes-19、Mes-20的单子囊孢子菌株群体的交配型，比例统计分析证实它们都为异宗结合种，并基于交配基因结构特点提出羊肚菌菌株交配型鉴定技术。研究中还分别得到了5个种的信息素受体基因MPRa和MPRb，并对其结构特征进行了比较研究，分析表明信息素受体基因在羊肚菌系统发育研究方面有重要意义。此外，以自己分离的M. importuna菌株YPL6为材料，人工栽培获得成功，收集了不同发育时期的子实体，利用细胞核染色技术，研究这些实体发育过程中子囊和子囊孢子的形成过程，提出了M. importuna的子囊发育和子囊孢子形成模式。这些研究工作为羊肚菌的栽培出菇奠定理论基础。本研究发表论文4篇（其中SCI 2篇），申请发明专利2项。