PI3K/Akt通路和SREBP-1联合调控对糖尿病肾小管上皮细胞脂质沉积影响的研究

糖尿病可引起肾小管上皮细胞脂质沉积，并导致间质细胞外基质沉积和纤维化。以往的研究证实高糖通过诱导肾小管上皮细胞转录因子SREBP-1上调而引起细胞内脂肪酸合成增多，甘油三酯聚集。PI3K/Akt通路的激活被揭示介导了高糖诱导的肾小管上皮细胞SREBP-1表达和脂质沉积。因此，对PI3K/Akt通路和SREBP-1的联合调控将更有效地减少肾小管上皮细胞的脂质沉积，然而PI3K/Akt通路是一个多功能的调控通路，我们的预实验证实针对Akt进行的基因沉默严重影响了细胞生长。如果能明确激活的Akt主要通过哪个下游分子靶点调控SREBP-1表达，针对这个主要分子靶点和SREBP-1进行联合调控，将能最大程度地减少肾小管上皮细胞脂质沉积而又不产生过多的副作用。因此，本研究拟针对PI3K/Akt下游分子靶点mTOR、PRAS40、Bad、GSK3β和FoxO1进行筛选，并在体内外验证联合基因调控的效果。

PI3K/Akt通路的激活参与了糖尿病高糖诱导的肾小管上皮细胞固醇调节元件结合蛋白1（SREBP-1）的表达和脂质沉积，本研究通过体外和体内实验对激活态Akt的下游靶基因进行检测，并探索了协同调控SREBP-1和Akt下游靶基因对糖尿病肾脏脂质代谢的影响。结果发现：（1）高糖刺激人肾小管上皮细胞48小时后，磷酸化GSK-3β（Ser 9）、磷酸化mTOR（Ser 2448）、磷酸化PRAS40（Thr 246）和磷酸化FOXO1（Ser 256）均增高，而磷酸化Bad未见变化；同时发现细胞内SREBP-1、脂肪酸合成酶（FASN）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、脂肪分化相关蛋白（ADRP）在高糖刺激后也出现升高。提示：除Bad外，其他Akt下游靶基因（GSK-3β、mTOR、PRAS40、FOXO1）均有可能参与了高糖诱导的肾小管上皮细胞脂质沉积。（2）将各待检测基因的野生型质粒和突变型质粒分别转染入高糖培养的人肾小管上皮细胞，揭示野生型GSK-3β、mTOR、PRAS40和FOXO1质粒可上调细胞内脂质代谢相关因子SREBP-1、FASN、ACC、ADRP和细胞内甘油三酯的含量。而突变型GSK-3β（S9A）质粒、突变型mTOR质粒（kinase dead mTOR质粒）、突变型PRAS40（T246A）质粒和突变型FOXO1（S256A）质粒均可不同程度地逆转野生型质粒对高糖培养的肾小管上皮细胞脂质代谢的影响，经过比较发现mTOR对肾小管上皮细胞内脂质含量的影响最大。（3）高糖培养的人肾小管上皮细胞共转染SREBP-1沉默质粒和kinase-dead mTOR质粒，用以协同调控SREBP-1和mTOR，结果显示：和单独沉默SREBP-1基因表达相比，协同调控SREBP-1和mTOR更有效地减少了SREBP-1、FASN mRNA、ACC mRNA、ADRP表达和细胞内脂滴的形成。（4）构建了糖尿病小鼠模型，经尾静脉注射方法将质粒注入小鼠体内，结果证实和单独注射SREBP-1沉默质粒相比，联合注射SREBP-1沉默质粒和kinase dead mTOR质粒可更有效地减少肾脏脂质沉积。本研究明确了糖尿病肾脏脂质沉积中的两个关键因子（mTOR和SREBP-1），进一步进行联合调控并取得可喜的干预效果，为疾病的防治提供了可靠的干预靶点和可行的实施措施。