Wolbachia介导的piRNAs及其靶标基因在果蝇精子发生中的功能研究

piRNAs were a class of small non-coding RNA found in recent years, which had enrichment phenomena in animal germ cells indicated their important role on gametogenesis. Recent studies had found that piRNAs could affect sex differentiation in Silkworm and sperm maturation process in mice through gene regulation. However, it had not been entirely clear about piRNAs function and mechanism in insects reproduction. Our previous study found that symbiotic bacteria Wolbachia infection in Drosophila could result in male fertility decreased. What’s more, 83 piRNAs expression were up-regulation in testis when Drosophila were infected by Wolbachia. We hypothesized that the up-regulation of piRNAs may destroy Drosophila spermatogenesis through inhibiting the transcription level of target genes. Our project intends to predict the target gene of piRNAs using software, and utilize cell transfection method and dual luciferase reporter system to identify target gene; detect if male flies fertility were declined after target gene RNA was knocked down in testis, in order to explore the function and mechanism of piRNAs with their target gene in Drosophila spermatogenesis.These results will not only help us further understand the mechanism of gene regulation during animals gametogenesis, but also have important reference value for the study of mechanism in senior animals male sterile.

piRNAs是近年来被发现的一类非编码小RNA分子，在动物生殖细胞中的富集现象表明其在配子的发育过程中发挥重要作用。最近研究发现，piRNAs可以通过调控靶标基因来影响家蚕的性别分化和小鼠的精子成熟，但是piRNAs在昆虫生殖中的功能和机制还未被阐明。我们前期研究发现，感染共生菌Wolbachia的果蝇（雄性不育）精巢中83种piRNAs的表达水平显著上调。我们提出假设上调的piRNAs可能通过抑制靶标基因转录,破坏了果蝇的精子发生，从而导致雄性不育。本项目拟通过软件预测上调piRNAs的靶标基因，通过细胞转染及双荧光素酶报告系统揭示piRNAs对靶标基因的调控作用；通过对精巢中靶标基因的RNA干扰，检测雄蝇生殖力变化，阐明piRNAs及靶标基因在果蝇精子发生中的功能及作用机制。研究结果不仅有利于我们进一步了解动物配子发生的基因调控机制，对研究高等动物的雄性不育发生机制也具有重要参考价值。

沃尔巴克氏体（Wolbachia）是昆虫体内分布最广的一种次生内共生菌，首次发现于尖音库蚊（Culex pipiens） 的卵巢中，目前被发现存在于多种昆虫、蜘蛛和螨类等节肢动物体内。Wolbachia能够通过多种方式调控宿主的生殖，如诱导胞质不亲和（cytoplasmic incompatibility，CI）、孤雌生殖、雌性化、雄性胚胎致死和增强等。其中，CI 是最普遍的一种方式，即当仅有雄性宿主感染 Wolbachia，或雌、雄宿主感染不同品系时，后代不能存活，在胚胎期死亡。在真核生物中，小分子非编码 RNA 引发一系列序列特异性的基因表达负调控作用，包括 RNA 干扰、翻译抑制和异染色质形成等，这一现象被称为 RNA基因沉默作用。本项目通过对Wolbachia感染（Dmel wMel）和未感染果蝇(Dmel T) 进行小RNA测序，在感染wMel的果蝇精巢中共有134种piRNAs的表达水平出现显著改变，其中，大多数piRNAs（83种）显著上调。通过软件预测差异表达piRNAs的靶标基因，从生物进程看，主要与新陈代谢、生物调控、发育、定位、生殖和生物粘附等相关；从细胞组分看，涉及到细胞器、膜封闭腔、胞外组分等；从分子功能上看，与转录调控、大分子结合、催化反应、酶调控和翻译调控等相关。此外，通过预测miRNA靶标基因、双荧光素酶标记，RNAi以及免疫组化等方法，发现nov-miR-12能够结合靶标基因psq UTR区，并且psq在精巢中的敲降降低了雄性果蝇的生殖力，影响了后代胚胎中核分裂，最终影响了雄性育性。本项目的完成揭示小 RNA 在精子发生中功能及作用机理，而且有利于探索共生菌调控昆虫生殖活动的功能及机制，并可能为害虫防治、益虫利用提供新策略。