基于CRISPR/Cas9技术获得高直、支链淀粉木薯新种质的研究

Cassava starch is an important raw material for food processing, industrial modified starch, feed and biomass products (fuel ethanol). Starch is composed of amylopectin and amylose. The high amylopectin starch has the advantages of easy pasting, good taste, high solubility and good transparency, and is more suitable for food processing, feed and industrial modified starch. High amylose starch has more advantages in ethanol production and film formation.Therefore，it is an important target to cultivate high amylose and high amylose starch varieties according to different uses. CRISPR/Cas9, a powerful gene editing tool, has been successfully used in a variety of organisms, including plants. In this study, CRISPR/Cas9 technology was used to edit the granule bound starch synthase GBSSI, GBSSII and starch branching enzyme SBEI, SBEII.Six plant expression vectors were constructed by using pRLG103 as the backbone vector, andwere transformed into a fine cassava variety Southern China 8. Then we compared the function of the target gene, analyzed the field agronomic traits of the mutant and detected the proportion of amylopectin and amylose content.Finally, the genetic stability of high amylose and high amylose cassava germplasm was screened out, which will provide a theoretical basis for the use of biotechnology to improve the quality of cassava.

木薯淀粉是食品加工、工业变性淀粉、饲料和生物质产品（燃料乙醇）的重要原料，淀粉由支链淀粉和直链淀粉组成，高支链淀粉具有易糊化、口感佳、溶解性高、透明度好更适于食品加工、饲料及工业变性淀粉，而高直链淀粉在乙醇生产、成膜性上更具优势，因用途不同培育高支链和高直链淀粉新品种成为木薯育种的重要目标。CRISPR/Cas9系统作为功能强大的基因编辑工具成功用于包括植物在内的各种生物。本研究拟利用CRISPR/Cas9技术定点编辑颗粒结合型淀粉合成酶 GBSSI、GBSSII（编辑后可获得高支链淀粉种质）和淀粉分支酶SBEI、SBEII（编辑后可获得高直链淀粉种质），以pRLG103为骨架载体构建植物表达载体六个，转化木薯优良品种华南8号，进行靶基因功能比较，突变体田间农艺性状分析，支链和直链淀粉含量比例测定，最终实现筛选出遗传稳定的高支链和高直链淀粉木薯新种质，为利用生物技术改良木薯品质提供理论依据

木薯广泛种植于全球热带地区。木薯淀粉是食品加工、工业变性淀粉、饲料和生物质产品（燃料乙醇）的重要原料，可分为直链淀粉和支链淀粉，具有不同的用途。CRISPR/Cas9系统作为功能强大的基因编辑工具已被成功用于编辑包括植物在内的几乎各种类型生物的基因。本研究利用CRISPR/Cas9技术定点编辑淀粉合成酶GBSS基因和淀粉分支酶SBE基因以获得高直链和高支链淀粉的木薯新种质。项目基本按计划执行，主要取得以下几个方面研究的研究进展：一、木薯遗传转化再生体系的建立及优化，通过培养基配方和农杆菌转化参数的优化获得了较多的胚性脆性愈伤，遗传转化效率得以提高；二、以pRLG103为骨架载体，成功构建了淀粉合成酶GBSS和淀粉分支酶SBE基因编辑植物表达载体并用木薯“华南8号”进行遗传转化；三、对获得木薯淀粉相关酶基因编辑的转化植株提取植物总DNA进行PCR扩增相关基因并Sanger测序，初步结果表明基因编辑载体对木薯基因组具有编辑效果；四、目前已获得的一批基因编辑木薯材料正进行大田试验，进一步的田间农艺性状鉴定和理化指标分析还待后续完成；五、克隆了木薯U6启动子并连接gus基因进行实验，GUS染色试验表明其具有良好的表达效果，以此申请了一项专利并获批；六、丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)是C4光合作用的关键酶，对MechlPPDK基因在木薯中的表达进行了分析并构建RNAi载体转化木薯；七、在全基因组范围内鉴定木薯Dof转录因子、水通道蛋白和叶绿素a/b结合蛋白超基因家族等。通过以上几部分的工作，基本达到了研究目标，为研究木薯基因功能、利用生物技术改良木薯品质提供了理论依据，为培育出高品质淀粉木薯、促进木薯产业的更好发展打下了一定基础。