疣粒野生稻抗病候选基因克隆及在转基因水稻中的功能验证

疣粒野生稻具有高抗或免疫白叶枯病的特性，是拓宽栽培稻品种遗传基础，改良水稻的重要资源。本实验室已从疣粒野生稻受白叶枯病菌诱导的差减文库中获得了一些抗病候选基因cDNA，如ME281具有CC-NBS-LRR抗病结构域，与苹果属的一个抗病基因有88%的相似性。ME007与药用野生稻编码的金属硫蛋白的氨基酸序列同源性达到87%，为可溶性蛋白类。ME207与泛素结合酶E2有较高的同源性，并推测其蛋白可能属于跨膜类蛋白。本研究拟从云南疣粒野生稻中获得有研究价值的抗病候选基因的全长cDNA序列，并通过构建带安全筛选标记的过量表达载体和RNAi表达载体，转化栽培稻，对转基因植株进行分子鉴定、表型观察和抗性鉴定。同时克隆候选基因启动子，进行表达谱分析，并构建GFP表达载体，进行亚细胞定位，确定候选基因的功能。为进一步克隆疣粒野生稻抗病新基因尤其是抗白叶枯病基因，揭示疣粒野生稻抗白叶枯病机制奠定基础。

白叶枯病是目前危害水稻最主要的细菌性病害之一，近年来，白叶枯病危害呈逐年加重的趋势。依靠传统的化学防治不但成本高而且也不环保，培育和种植抗病品种是最经济、最有效和最安全的防治措施。鉴于栽培稻来源的抗病基因（R）抗病谱窄，从野生稻中发掘R基因仍是目前的主要途径。云南具有丰富的野生稻资源，其中疣粒野生稻对白叶枯病高抗甚至达到免疫，是稻属中唯一的广谱长久抗病材料，非常值得发掘利用。本课题组前期构建了疣粒野生稻受白叶枯病菌诱导的抑制差减文库（SSH文库），获得了大量EST序列。本项目经过初步分析，从该SSH文库中选取部分EST序列，通过RACE技术，克隆了5个可能与抗白叶枯病相关的基因（ME022、ME085、ME094、ME137和ME255）的全长cDNA序列，并进行了编码蛋白质一级结构分析，功能域、信号肽和亚细胞定位预测。选取可能与抗病有关的ME094基因构建了带安全筛选标记的过量表达载体和RNAi载体，通过农杆菌介导法转化栽培稻，经分子检测，获得了一些阳性转基因植株，并对转基因植株进行了表型观察和抗性鉴定，获得抗性明显增强的转基因植株和目标基因表达受到干涉的转基因植株。同时，克隆了ME094基因的上游启动子，构建了与GUS基因融合的表达载体，转化拟南芥进行GUS化学染色分析，发现该基因启动子主要在较老叶片中表达。此外，还构建了ME094基因与GFP融合的表达载体，转化拟南芥进行亚细胞定位，通过显微镜观察，发现ME094蛋白定位于细胞核中。以上结果表明，ME094基因与疣粒野生稻抗白叶枯病有一定的关系，过表达该基因能一定程度上提高水稻对白叶枯病的抗性。本项目的研究结果为进一步发掘疣粒野生稻抗病新基因尤其是抗白叶枯病基因，进而揭示疣粒野生稻抗白叶枯病机制提供了理论参考。