CaOx导致的TJs损伤及TJs自我修复影响晶体粘附的信号转导调控

In the previous two National Natural Science Foundation research projects, we had found CaOx adhere to renal tubular epithelial cell. The latest studies show that tight junctions (TJs) plays the potential role base on the door control switch and barrier function: CaOx bring injury to TJs, which promotes crystal adhesion, while TJs self-repair can decrease the crystal adhesion, but the detail mechanism is unknown. In the signaling pathways of TJs assembly regulation, Ca2+ impact TJs in the way that change ZO-1/actin protein, Occludin protein position and Na-K-ATPase. The research on signal transduction of injury brought by CaOx to Tjs that promote adhesion of CaOx and TJs self-repair will help us to understand the calcium oxalate stones formation mechanism. Thus, based on our previous research experience and foreign research advance, we plan the research that, through the C14 labeled CaOx to damage TJs in MDCK cells and get TJs injury model cells, radioactive liquid scintillation, polarized light microscopy, Ussing chamber, molecular biology, radioimmunoassay and other means to detect the expression and structural position of major structural protein as ZO-1 and Occludin, Na-K-ATPase expression, cell membrane resistance and TJs contact point s, to investigate the mechnism that of regulation of signal transduction in the procedure of TJs injury induced by CaOx and TJs self-repair influence the crystal adhesion.

课题组在前2个国家自然科学基金项目的研究中发现，CaOx粘附于受损肾小管上皮细胞。最新研究显示，由TJs发挥的门控开关以及屏障作用可能起着一定作用：CaOx破坏TJs，促进晶体粘附；受损TJs重新组装自我修复，降低晶体粘附；但具体的机制尚不明确。Ca2+调控在TJs组装信号途径中，通过改变ZO-1/肌动蛋白结合及Occludin位置协同Na-K-ATP酶对TJs产生影响。研究其信号转导途径，将有助于研究草酸钙结石病因。结合课题组既往研究积累及国外研究进展，我们拟采用C14标记的CaOx制作MDCK细胞及TJs损伤模型，通过放射性液闪仪、偏光显微、Ussing chamber及分子生物及放射免疫等手段检测TJs主要结构蛋白ZO-1及Occludin的表达与结构位置、Na-K-ATP酶表达、细胞跨细胞膜电阻、TJs接触点等，探讨CaOx导致TJs损伤及TJs自我修复影响晶体粘附的信号转导调控。

草酸钙晶体尿刺激肾小管上皮细胞，破坏细胞极性和细胞之间的紧密连接并影响上皮细胞的相关功能，使得肾小管尿路上皮对尿液中钙离子的重吸收能力被破坏，草酸钙晶体更加容易生成且粘附在上皮细胞上，可能恶性循环促进了草酸钙结石形成，但其中具体作用机制并不明确。本研究通过草酸钙结石大鼠模型以及细胞实验，探讨了草酸钙晶体尿对肾小管上皮细胞及细胞间紧密连接（TJs）损伤促进草酸钙晶体形成及粘附，而TJs的自我修复则逆转草酸钙晶体的粘附，以及潜在的调节机制。. 我们对MDCK细胞分别给予不同浓度的一水草酸钙晶体（COM）刺激48h后，分别利用细胞免疫荧光和Western blot两种方法检测发现COM能够浓度依赖性下调TJS两种蛋白分子Occludin和ZO-1。分别对未给予EGTA破坏TJs组、EGTA损伤后修复1min、30min和180min组进行ZO-1蛋白和Na+-K+-ATPase蛋白进行免疫荧光染色，并加入一定浓度的COM晶体孵育后观察TJs损伤对COM晶体粘附能力的影响。结果显示，EGTA引起的低钙造成ZO-1的显著性破坏，随着修复时间的延长，ZO-1逐渐向损伤前水平恢复；而Na+-K+-ATPase的表达在修复期1min时表达最强，随着修复时间的延长，逐渐向损伤前水平恢复。这反映了TJS的损伤以及自我修复的动态变化，且TJs破坏后显著增加对COM的粘附能力，而随着TJs的修复，晶体的粘附显著减少。紧密连接组装的信号途径中，最具有特征性的是Ca2+调控模型。草酸钙晶体引起氧化应激致肾小管上皮细胞处于低氧环境，上皮功能受损同时伴有TJs损伤，而细胞内钙短暂升高，改变ZO-1/肌动蛋白的结合及Occludin在细胞中的位置，引起细胞渗透性变化，激发Na+-K+-ATPase的表达使TJs进入修复环节。. 草酸钙晶体尿损伤肾小管上皮细胞，导致TJs损伤（ZO-1、Occludin等变化），引起细胞内外Ca2+变化，随后Na+-K+-ATPase表达水平和活性反馈性上调以促进TJs的形成和修复，肾小管上皮处理Ca2+能力得到改善。TJs修复与草酸钙晶体粘附出现此长彼消的动态平衡，而这一理想的动态平衡一旦被打破，草酸钙晶体破坏TJS，肾小管处理Ca2+能力破坏后，草酸钙晶体更易形成，且粘附在肾小管上皮上，以此为核心快速形成草酸钙大颗粒，并最终形成草酸钙结石。