褪黑素通过RIPK1/RIPK3-Nrf2/ARE信号轴调控坏死性凋亡以缓解压力诱导的椎间盘源性腰痛的机制研究

Interaction between nucleus pulposus (NP) cells death and local inflammation is an important inducement of discogenic low back pain (LBP), however, there is lack of effective treatment for LBP. The applicant reported that compression-induced NP cells necroptosis via RIPK1/RIPK3/MLKL pathway, implying that the regulation of necroptosis might be a new target for the prevention and treatment of discogenic LBP. Our preliminary experiments indicated that inhibition of RIPK1/RIPK3 axis activity down-regulated the expression of inflammatory factor IL-1β in intervertebral disc and pain mediator COX-2 in dorsal root ganglion, and activated the core element Nrf2 of anti-inflammatory component Nrf2/ARE. Melatonin significantly resists inflammation and alleviates LBP, and our preliminary experiments showed that melatonin down-regulated the expression of RIPK1 and RIPK3 in NP cells under compression condition. Based on above, we hypothesized that: melatonin could regulate RIPK1/RIPK3-Nrf2/ARE signal axis to inhibit compression-induced NP cells necroptosis and inflammatory reaction in intervertebral disc. We plan to employ the controllable pressure model in vivo and in vitro, and adopt SiRNA interference technology and gene overexpression technology, to verify the above hypothesis from molecule, cell, tissue and organ levels. This project will reveal the mechanism of discogenic LBP from a new perspective and provide a new strategy for its effective prevention and treatment.

髓核细胞死亡与局部炎症相互作用是椎间盘源性腰痛的重要诱因，但缺乏有效治疗手段。申请者前期研究发现压力经RIPK1/RIPK3/MLKL途径诱导髓核细胞坏死性凋亡，提示调控坏死性凋亡有望成为防治椎间盘源性腰痛的新靶点。我们预实验显示，抑制RIPK1/RIPK3活性可下调压力诱导的椎间盘炎性因子IL-1β和背根神经节疼痛介质COX-2表达以及激活抗炎元件Nrf2/ARE核心成分Nrf2。褪黑素可显著抗炎及缓解腰痛，且我们预实验表明褪黑素下调压力诱导的髓核细胞RIPK1及RIPK3表达。综上，我们提出假设：褪黑素可调控RIPK1/RIPK3-Nrf2/ARE信号轴以抑制压力诱导的髓核细胞坏死性凋亡及椎间盘炎症反应。我们拟应用体内外可控压力模型，采用SiRNA干扰、基因过表达等手段，从分子、细胞、组织、器官等水平验证该假设。本研究将从新的角度揭示椎间盘源性腰痛的机制，并为其有效防治提供全新的策略。

腰背痛是临床极常见疾病，给患者带来巨大痛苦，还造成严重的社会经济负担。椎间盘退变是引起腰背痛的重要原因。髓核退变是椎间盘退变的始动及核心因素，与RIPK1/RIPK3/MLKL信号轴介导的髓核细胞坏死性凋亡密切相关。. 本课题研究：（1）压力诱导下髓核细胞坏死性凋亡与凋亡、坏死性凋亡与自噬之间的相互调控作用；（2）联合调控坏死性凋亡与凋亡、坏死性凋亡与自噬、以及三者联合调控对压力诱导的髓核细胞存活的影响；（3）并从线粒体层面探索其发生的确切分子机制。.HSP70是一种主要的细胞保护性热休克蛋白，通过细胞实验及在体动物模型，评估：（1）压力诱导下，HSP70是否可有效抑制髓核细胞凋亡；（2）线粒体分裂融合失衡在压力导致髓核细胞凋亡中发挥的作用；（3）HSP70是否通过抑制线粒体分裂融合失衡达到抑制髓核细胞凋亡的效果，线粒体去乙酰化酶SIRT3在其中发挥的作用。. 结果证实，坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1有效抑制压力诱导的髓核细胞自噬，自噬抑制剂3-MA对坏死性凋亡水平影响不大。Necrostatin-1+3-MA联合干预在降低髓核细胞死亡方面的作用几乎与Necrostatin-1单独处理相同；Necrostatin-1有效抑制髓核细胞凋亡，凋亡抑制剂Z-VAD-FMK加剧压力诱导的细胞坏死性凋亡；与Necrostatin-1相比，Necrostatin-1+Z-VAD-FMK联合干预在抑制细胞死亡方面的作用更为显著，与线粒体膜电位增加、线粒体膜通透性转换孔开放减少和氧化应激水平下调一致。综上所述，Necrostatin-1和Z-VAD-FMK协同干预可更加有效地抑制压力诱导的髓核细胞死亡，在很大程度上可能归因于线粒体功能的恢复和氧化应激水平下调。. 细胞实验和动物模型均证实，促进HSP70表达在很大程度上保护髓核细胞免受压力损伤；HSP70可通过促进粒体去乙酰化酶SIRT3的表达抑制压力诱导的线粒体分裂融合失衡，从而减弱线粒体功能障碍和过多的活性氧产生，并最终抑制髓核细胞线粒体凋亡途径。总之，结果表明HSP70可通过促进SIRT3的表达，进而抑制线粒体分裂融合失衡，最终减轻压力诱导的髓核细胞凋亡。. 以上研究有望为椎间盘退变及腰背痛的有效防治提供全新的思路和研究方向，为有效防治腰背痛的新药研发提供重要依据，具有重要的科学