长链非编码RNA uc003zpr.2通过PCP4途径调节醛固酮分泌的机制研究

Primary aldosteronism（PA） is of high incidence in secondary hypertension，and the disease causes heavy damage. But the mechanism of the disease has not been fully revealed.Previous studies have shown that PCP4 could positively regulate the expression of aldosterone synthase(CYP11B2) and aldosterone secretion.This action of PCP4 is via regulating the intracellular calcium level by accelerating calcium association and dissociation with calmodulin(CaM). In our previous work,we have found that long non-coding RNA(lncRNA) uc003zpr.2 was specificially upregulated in the PA samples,and it was highly associated with the expression of PCP4.In H295R cells,Knocking down of lncRNA uc003zpr.2 decreased the PCP4 and aldosterone synthase(CYP11B2) expression levels,whereas overexpression of lncRNA uc003zpr.2 increased PCP4, aldosterone synthase(CYP11B2) levels and aldosterone production，these suggest that lncRNA uc003zpr.2 may play a key role in the primary aldosteronism. Based on theses findings,we hypothesize that lncRNA uc003zpr.2 may regulate the expression of PCP4 by combining a specific target gene or protein,and then increase the intracellular calcium, aldosterone synthase(CYP11B2) levels and aldosterone production.We plan to further detect the mechanism underlying the effect of lncRNA uc003zpr.2 on PCP4 expression,and explore the role of lncRNA uc003zpr.2 in the pathogenesis of primary aldosteronism.

原发性醛固酮增多症为发病率较高的继发性高血压且危害较大，有关发病机制尚不完全清楚。已有研究提示PCP4蛋白可通过调控钙调蛋白CaM和钙离子的结合和解离速度来调控钙离子水平达到调控醛固酮合成酶(CYP11B2)的表达，从而增加醛固酮合成。我们发现长链非编码RNA(lncRNA) uc003zpr.2的表达与PCP4表达相关并在原发性醛固酮增多症升高，体外过表达或沉默uc003zpr.2，PCP4和醛固酮合成酶mRNA和蛋白表达量出现增加或减少相应变化，故uc003zpr.2 可能在原发性醛固酮增多症形成中起重要作用。据此我们提出科学假设： uc003zpr.2通过靶分子上调PCP4和醛固酮合成酶基因的表达，促进醛固酮合成。本研究的目的就是探讨这些与uc003zpr.2结合蛋白或DNA或RNA序列，明确其调控PCP4的机理，进一步阐明原发性醛固酮增多症发病机制。

原发性醛固酮增多症是继发性高血压的主要原因，由于其高发病率和危害，阐明原发性醛固酮增多症的发病机制，提出针对病理生理机制的干预靶点与措施，对有效控制原发性醛固酮增多症患者的并发症具有重要意义。我们的前期研究发现lnc RNA uc003zpr.2 不仅仅在产生醛固酮的腺瘤组织中表达增加，而且在特发性肾上腺增生的患者组织中也表达增加，且与正常肾上腺组织的表达差异明显，并通过PCP4参与醛固酮增多症的发病机制。.以lncRNA uc003zpr.2两种不同的RNAi在50nmol 的浓度分别在NCI-H295R和 SW13 (bottom panels) 肾上腺细胞系以RNAi的方法抑制PCP4的表达，见到在两种不同的细胞系均可见到PCP4的表达下降，在NCI-H295R细胞系分别下降60%和92%，在SW13细胞系分别下降87%和85%。提示uc003zpr.2有调节PCP4的作用。.本研究就lnc RNA uc003zpr.2 的发病机制进行研究，以RNA pull-down 结合质谱分析得到237 个蛋白分子符合筛选原则的蛋白，对其中32个蛋白分子进行的研究，结果没有发现其对PCP4及醛固酮的分泌有影响。.以CHIRP-Seq( Chromatin Isolation by RNA Purification )技术进行与lncRNA uc003zpr.2结合的RNA，发现有4876条RNA可能与lncRNA uc003zpr.2结合，GO数据和KEGG数据分析可能影响醛固酮分泌的RNA，研究了多个RNA对醛固酮合成的影响，发现miRNA-4463可能参与原醛的发病。.在醛固酮瘤与瘤旁组织样本中，qPCR分析miRNA-4463的表达水平，发现lncRNA uc003zpr.2与miRNA-4463表达的正向关系；用NCI-H295R和SW13细胞株改变miRNA-4463的表达，发现增加miRNA-4463的表达，可增加PCP4的表达，CCK8细胞活性测定细胞生长曲线提示细胞生长被增强。以RNAi抑制miRNA-4463的表达，lncRNA uc003zpr.2调节PCP4表达的作用减弱，提示lncRNA uc003zpr.2通过miRNA-4463调节PCP4的表达，从而调节醛固酮分泌。.研究提示PCP4表达改变与细胞的增殖有关，PCP4的抑制导致细胞凋亡增加，