猪链球菌2型次黄嘌呤核苷酸脱氢酶对细菌致病性影响的调控机制

猪链球菌2型（SS2）是一种重要的人兽共患病原菌，次黄嘌呤核苷酸脱氢酶（IMPDH）新近被证实是SS2的一种毒力相关因子。为进一步探讨IMPDH影响SS2致病性的调控机理，本项目将开展以下研究：以3株不同来源不同毒力基因表现型的SS2强毒菌株作为亲本株，构建IMPDH缺失株（IMPDHm），首先比较缺失株与亲本株对敏感动物的致病性（已构建好一株IMPDHm，并证实其对BALB/C小鼠和猪致病性有明显降低），进而利用基因芯片技术与2D-电泳技术，分别从基因组和蛋白组水平比较IMPDHm与亲本株相关毒力基因与蛋白表达的差异,同时研究IMPDH缺失对其碳源代谢谱的影响。本研究将揭示IMPDH作为酶类，可能通过调控其他毒力相关因子的表达以及营养代谢而降低SS2致病力的机制，同时还可能发现新的毒力相关因子，为进一步揭示SS2的致病机理、更加有效防控猪链球菌病提供依据和手段。

本项目采用同源重组技术敲除两株猪链球菌2型菌株（ZY05719、GN0612）的impdh基因，结合前期获得的SS2-H菌株impdh基因缺失株，分析了3株缺失株与相应亲本株之间的培养特性、营养代谢分析以及敏感动物的致病性，另外通过基因芯片和分泌蛋白组技术，比较了缺失株与亲本株在转录、蛋白表达水平上的差异。结果显示，3株缺失株生长曲线的迟缓期略长于亲本株，其它情况与亲本株较为一致；缺失株与相应亲本株对48种代谢底物的利用情况几乎接近；以小鼠为攻毒模型，ΔZY、ΔGN较亲本株的毒力有所下降，以本体动物猪为攻毒模型，结果显示ΔZY较亲本株的毒力弱，总体而言，敲除impdh基因确实对猪链球菌2型菌株的致病力有所致弱。利用猪链球菌2型的表达谱芯片，比较了3组亲本株、缺失株的转录水平差异，发现敲除impdh基因后，3株亲本株存在共性的下调基因，包括荚膜多糖合成、菌毛合成的部分基因，另外ZY、GN敲除impdh后，多数核糖体蛋白亚基、细胞壁合成的编码基因同样存在共性的下调现象。比较ZY、ΔZY之间的分泌蛋白谱，结果提示磷酸丙糖异构酶（TPI）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）在ΔZY菌株中的表达显著下调，相对定量PCR显示TPI、GAPDH在ΔZY菌株中的转录较ZY显著下调，TPI、GAPDH同为糖酵解酶，参与糖酵解途径，推测ΔZY丢失利用甘露糖能力的表现可能与TPI、GAPDH表达下调相关，此外，TPI、GAPDH是链球菌表面的纤溶酶原受体（PlgR），与PlgR结合的纤溶酶原可转化形成纤溶酶，该酶有助于细菌侵袭组织内部。细胞粘附试验证实，ΔZY粘附Hep-2、PK15细胞能力较ZY显著下调，由于病原菌粘附宿主细胞是感染发生的重要步骤，因此，ΔZY粘附细胞能力的下降一定程度上解释了ΔZY致病力的下降。.本项目资助发表论文9篇，其中SCI收录1篇，被授权国家发明专利1项。