CRIF1在骨髓间充质干细胞辐射损伤耐受中的作用及其机制研究

辐射通过氧自由基、DNA损伤导致细胞过氧化损伤、功能异常以及凋亡。研究结果提示，骨髓间充质干细胞（BMSCs）的辐射耐受性强于造血实质细胞，可能缘于辐射诱发其产生抗氧化、DNA损伤修复的自我保护反应，具体机制未完全阐明。我们前期实验发现，辐射后12小时为临界点，人BMSCs 表达CRIF1水平先下降后上升，并发生G1期阻滞。已知CRIF1-NRF2、CRIF1-Gadd45途径可分别促进细胞抗氧化损伤、DNA损伤修复。因此，我们提出：辐射后BMSCs表达CRIF1水平下降参与氧化损伤修复、上升参与DNA损伤修复。为此，本项目通过体外实验在不同时相点研究CRIF1在BMSCs耐受辐射损伤中的作用，在此基础上进一步研究CRIF1-NRF2途径参与辐射后早期BMSCs氧自由基损伤修复、CRIF1-Gadd45途径参与其后期DNA损伤修复的作用机制，以补充阐明BMSCs耐受辐射损伤的分子机制。

从辐射耐受细胞中探索其如何逃逸辐射损伤对放射病发生发展的病理生理机制认识和新的治疗手段探寻都具有重要意义。课题组前期研究发现，Crif1高表达于BM-MSCs和U2OS细胞，且其表达水平与辐射耐受密切相关。故拟采用此两种细胞研究Crif1在辐射耐受中的作用机制。主要研究内容包括：BM-MSCs的分离、培养和鉴定；Crif1表达调控慢病毒载体的构建；Crif1表达调控后与Nrf2及其下游Ⅱ相解毒酶在辐射后的表达变化；Crif1调控细胞周期的机制（项目拟计划研究Gadd45，根据实验结果调整为CDK2）；Crif1对辐射后BM-MSCs分化的影响等。. 在完成研究计划并根据实验数据作出细微调整的基础上，取得下列研究结果：①成功分离BM-MSCs，改良其培养体系，根据形态、表面标志物和诱导分化能力鉴定所得细胞为BM-MSCs。②根据辐照后细胞状态和Crif1及Nrf2表达变化，确定最佳辐照剂量为9 Gy、最佳检测时间为4 h和12 h，成功构建Crif1过表达和siRNA慢病毒载体并建立稳定表达调控的BM-MSCs和U2OS细胞模型，发现Crif1表达降低后显著抑制辐射应激导致的Nrf2及其下游部分Ⅱ相解毒酶的表达水平升高、导致ROS在胞内累积并破坏线粒体的形态。③Crif1表达调控后对G0/G1期细胞分布比例影响最大（对照 v.s. 干扰，48.8±4.72% v.s. 33.17±3.25%）而Gadd45主要阻滞细胞于G2/M期，且Crif1表达调控和辐射后与Gadd45表达水平变化并无明显相关性，表明Crif1对细胞周期的调控作用不是通过Gadd45发挥。通过Co-ip、GST-pulldown、免疫荧光等证实Crif1与CDK2之间存在直接相互作用，抑制Crif1表达水平后可导致辐射应激后CDK2核转位受阻、阻滞于G0/G1期细胞减少、DNA修复反应延滞及细胞凋亡加剧。④在骨肉瘤细胞系U2OS和病理组织中均发现Crif1高表达，推测其高表达与骨肉瘤的辐射耐受成正相关。⑤辐射后Crif1表达水平升高与BM-MSCs辐射后的克隆形成能力、成脂成骨分化调控密切相关。基于以上结果，我们初步明确Crif1在辐射后主要通过Nrf2、CKD2、PKA分别参与细胞的氧化应激、周期阻滞和分化调控，从而逃逸辐射损伤；为阐明辐射损伤和抵抗的分子机制奠定了基础。