丹参酮合成途径中新基因簇的功能分析和分子调控机制研究

Most major medicinal effective ingredients of Chinese herb plant are belong to secondary metabolites. The co-located and co-expressed gene clusters involved in secondary metabolic pathway provide novel method to discover key enzyme gene and further elucidate whole metabolic pathway in Chinese herb plant study. Salvia miltiorrhiza Bunge is one of the most important root medicinal herbs with root in China, however its tanshinone synthesis downstream pathway has not been unclear yet. The discovery of plant secondary metabolic gene clusters (MGCs) provided a new direction for mining key enzyme genes and analyzing its synthesis pathway. MGCs related to diterpene synthesis was found in a high-quality S. miltiorrhiza genome obtained by our group. In this study, using transcriptome data and fluorescence quantitative analysis, we will analyze tissue expression characteristics and screen candidate genes and MGCs related to tanshinone synthesis with the co-expression pattern. Heterologous expression and transgene will be used to verify the function of these candidate genes in the synthetic pathway. The regulation mechanism of chromatin spatial conformation, genome-wide methylation and histone modification on MGC expression by combining BS-Seq, ChIP-Seq and Hi-C analysis with RNA-Seq data. This study is expected to mine 1-2 key enzyme genes in tanshinone synthesis pathway which will lay an important foundation on tanshinone synthesis downstream pathway, and provide reference for related study of other medicinal plants.

多数中药的药效成分都属于植物次生代谢物质。植物次生代谢共定位、共表达基因簇的存在，为研究药用植物关键酶新基因、解析代谢途径提供了一条新的道路。丹参是我国重要的根类药材，其药效成分丹参酮合成下游途径至今尚未明确。.项目组利用新组装的丹参基因组数据，发现在1号染色体的长、短臂各存在一个与二萜类物质合成相关的TPS/CYP450和TPS/2OGD基因簇，推测其在丹参酮合成途径起到重要作用。本研究将对这两个基因簇利用转录组、荧光定量技术分析其时空表达特征，结合共表达模式筛选与药效成分合成相关的关键基因；利用异源表达、转基因等方法验证这些候选基因在丹参酮合成途径中的功能；利用BS-Seq、ChIP-Seq、Hi-C结合RNA-Seq数据，从表观遗传学角度解析调控基因簇表达调控的分子机理。本研究不仅将为解析丹参重要药效成分合成途径奠定基础，同时也可为其它药用植物研究提供借鉴。

丹参是我国常用的大宗根类药材，丹参酮类是其重要药效成分，但其下游合成途径仍未完全解析。植物次生代谢共表达、共定位基因簇的存在，为通过基因簇来挖掘关键酶新基因、解析代谢途径提供了一条新的思路。本项目以DSS3为材料，通过PacBio三代测序和Illumina测序组装丹参基因组；综合基因组和转录组挖掘代谢基因簇，并利用分子生物学方法对其候选关键基因进行克隆、功能分析以及分子表达调控等研究。主要结果包括：（1）最终组装得到的丹参基因组大小为594.75 Mb， Contig N50和Scaffold N50的长度分别为2.70 Mb和69.8 Mb；其中584 Mb的数据锚定到8条染色体上；整合DSS3基因组和5个转录组数据，搭建了一个丹参基因组数据库（SmGDB），并应用于白花丹参突变研究，发现其SmANS关键序列丢失。（2）在DSS3基因组中共鉴定到333个CYP450基因，结合已知的丹参酮合成途径基因，根据定位信息和表达情况，鉴定出两个重要的基因簇，一个是包括SmCPS1、SmKSL1在内的4个CYP450构成的基因簇，另一个是包含7个同源性较高的CYP450构成的基因簇，其中SmCYP71D375、SmCYP71D373、SmCYP71D411.1、SmCYP71D441.1的共同在丹参红根周皮表达，是解析丹参酮合成途径的重要候选基因。（3）成功克隆SmCYP71D373、SmCYP71D411两基因，并构建了过表达载体和发根农杆菌的遗传转化，获得了阳性毛状根，UPLC检测发现过表达阳性毛状根比对照丹参酮含量显著提高，说明这两个基因促进丹参酮合成；并构建了酵母表达载体、并转化酵母进行诱导表达，为进一步明确催化功能奠定了基础。（4）分析基因簇中各基因1500bp启动子序列和顺式作用元件，发现共有多种激素和非生物胁迫响应元件，实验证明受多种激素的诱导，构建了丹参根系cDNA酵母文库，为挖掘调控基因或互作蛋白提供了必要的基础。