高效表达幽门螺杆菌黏附素的嗜酸乳杆菌菌株的构建及其免疫保护作用的研究

PCR扩增幽门螺杆菌保护性抗原黏附素基因hp0410，克隆入组成型表达穿梭质粒pMG36e中，通过电穿孔法将该重组质粒转化至嗜酸乳杆菌中，得到高效组成型表达，在体内外检测该重组质粒在嗜酸乳杆菌中的稳定性。将重组嗜酸乳杆菌免疫SPF级C57BL/6小鼠，采用ELISA法检测小鼠血清中特异性IgG类抗体和胃黏膜中SIgA类抗体的效价，ELISPOT和流式细胞术分析小鼠脾细胞Th1和Th2型细胞因子的水平，考察重组嗜酸乳杆菌诱发特异性免疫应答尤其是黏膜免疫的效果。用高致病性幽门螺杆菌SS1株分别攻击未经免疫和免疫后的SPF级C57BL/6小鼠，采用尿素酶试验、细菌分离培养、PCR扩增检测胃组织中的幽门螺杆菌，以及免疫组化实验检测胃组织炎症反应，考察重组嗜酸乳杆菌抗幽门螺杆菌感染的免疫保护效果。本项研究旨在为研制预防幽门螺杆菌感染的嗜酸乳杆菌活载体疫苗提供理论依据。

在国家自然科学基金项目的资助下，主要完成如下工作：.1．构建了表达幽门螺杆菌黏附素Hp0410的嗜酸乳杆菌重组菌株，并进行免疫保护作用的研究。.从幽门螺杆菌NCTC11639株染色体DNA中经PCR扩增出幽门螺杆菌黏附素hp0410基因，大小为750bp。将hp0410克隆入pMG36e，构建重组质粒pMG36e-hp0410，双酶切和DNA测序鉴定后，将重组质粒pMG36e-hp0410电转化入嗜酸乳杆菌，无需诱导，可成功表达目的蛋白Hp0410，分子量约为34kD，经Western blot检测，表达的目的蛋白与Hp感染阳性患者血清均能发生免疫学反应。在体外，重组质粒在红霉素选择压力下稳定性为97%，在没有红霉素选择压力下稳定性为95%。而在体内，动物实验证实，重组嗜酸乳杆菌可以在小鼠体内存留3-4天，可检出重组质粒。采用夹心ELISA 法，在小鼠肠黏膜和血清中可检出高效价的特异性IgG抗体和IgA抗体。将重组嗜酸乳杆菌通过口服方式免疫C57BL/6小鼠，再用高致病性Hp菌株SS1攻击，结果显示pMG36e-hp0410 组能明显拮抗Hp在胃黏膜上黏附定植，尿素酶和触媒试验均为阴性，定植的细菌数量显著减少，有效地拮抗幽门螺杆菌的感染，并可降低胃黏膜Hp感染病变和炎症程度。.2．构建了嗜酸乳杆菌食品级载体系统，下一步试图构建食品级的幽门螺杆菌嗜酸乳杆菌活载体疫苗。.①构建了α -半乳糖苷酶缺陷型嗜酸乳杆菌菌株：以PBR322为打靶载体骨架，以点突变PCR扩增嗜酸乳杆菌（ATCC 4356）LacF片段，连接于打靶载体，而后电转化嗜酸乳杆菌（ATCC 4356）感受态菌株，通过乳糖碳源筛选培养基筛选以及southern法鉴定缺陷菌株的基因型，从而成功得到半乳糖苷酶缺陷的嗜酸乳杆菌（ATCC 4356 △LacF）表达菌株。.②构建了α -半乳糖苷酶互补型质粒：在获得半乳糖苷酶缺陷型菌株后，以pLac质粒为框架，克隆RecA-RecC乳酸菌质粒复制子于该质粒上，并将上述所扩增的LacF互补筛选标记连接于互补载体上，继而将Nisin元件的启动子以及多克隆位点引入载体方便抗原基因以及其他基因的引入。.3. 发表SCI论文一篇，并被Clin Vaccine Immunol刊选为重点报道，并给予四百多字的新闻稿介绍。