三苯基锡和维甲酸X受体抑制剂(UVI3003)对热带爪蟾胚胎致畸机制的比较研究

Retinoid X receptor (RXR) is one of the most important targets of pollutants and drugs. Triphenyltin (TPT) is regarded as a typical agonist of RXR. However, our previous studies suggest that TPT induces unique teratogenicity in Xenopus tropicalis embryos. The TPT-induced teratogenic characteristics are much different from those induced by 9-cis-retinoic acid, the natural ligand of RXR, but similar to those by UVI3003, a highly selective agonist of RXR. Therefore, we deduce that TPT might induce teratogenicity in X. tropicalis embryos by inhibiting rather than activating the activity of RXR. In our project, we plan to test this hypothesis and study the teratogenic mechanisms of TPT and UVI3003 using comparative toxicogenomics. Firstly, gene expressions profiles will be analyzed using microarray, and the pathways will be deduced. Secondly, the results of gene expressions profiles will be validated using real-time PCR, and the most sensitive induced genes in response to TPT or UVI3003 will be selected. Effects of TPT and UVI3003 on gene expressions in specific tissue will be studied using in situ hybridization. Phenotypic anchoring will be applied to link the changes of gene expressions to the phenotypes of malformations in embryos. Finally, we will compare the pathways of TPT and UVI3003. On one hand, we will determine if TPT induces teratogenicity by inhibiting the activity of RXR. On the other hand, we will reveal the molecular mechanisms of teratogenicity induced in X. tropicalis embryos by TPT and UVI3003. The research findings will provide new understanding of RXR-mediated toxicity and scientific basis for assessing the effects of RXR antagonists on amphibian embryos.

维甲酸X受体(RXR)是化学污染物和药物作用的重要靶点，三苯基锡(TPT)被认为是典型的RXR 激动剂。然而，我们前期的研究却发现：TPT对热带爪蟾胚胎的致畸效应与RXR的自然配体9-顺维甲酸的截然不同，而与RXR高选择性抑制剂UVI3003的非常相似。由此我们推测TPT可能是通过抑制RXR的活性而致畸的。本项目拟运用比较毒理基因组学的方法对这一假设进行论证并研究RXR抑制剂的致畸机制。首先，运用基因芯片的方法解析TPT和UVI3003对胚胎作用的基因表达谱并分析作用通路；然后，通过对差异基因的定量分析验证基因表达谱的结果并筛选敏感的响应基因；运用整胚荧光原位杂交研究敏感基因在胚胎各组织的响应特征，并在基因响应与畸形表型之间建立联系；最后，阐明TPT是否为RXR的抑制剂并揭示TPT和UVI3003的致畸机制。成果将提供RXR介导毒性的新认识，为评价RXR抑制剂对两栖类的生态风险提供依据。

维甲酸X受体(RXR)是化学污染物和药物作用的重要靶点，三苯基锡(TPT)被认为是典型的RXR激动剂。然而，我们前期的研究发现：TPT对热带爪蟾胚胎的致畸效应与RXR的激动剂9-顺视黄酸和氟蓓萨罗汀的截然不同，而与RXR高选择性抑制剂UVI3003的非常相似。因此，本项目以热带爪蟾胚胎为主要实验模型，斑马鱼胚胎和Cos7细胞为辅助实验模型，系统运用了基因组学、qRT-PCR定量、显微注射、整胚原位杂交和细胞转染等技术，比较研究了TPT和UVI3003对热带爪蟾胚胎的致畸机制。项目首先建立了热带爪蟾胚胎畸形表型指标体系和污染物致畸敏感阶段的快速筛选方法，发现TPT和UVI3003的敏感作用时段分别在24-36 h （约 S32-S40）和12-36 h (约 S25-S40)，典型的畸形表型为鳍变窄、眼睛畸形、小头和泄殖腔膨大。其中，胚胎的鳍变窄主要是由细胞凋亡导致的。其次，通过核受体活性检测实验发现，在Cos7细胞（体外）和爪蟾胚胎体内TPT均是RXR的激动剂，无物种差异性存在。同时，出乎意料地发现TPT和UVI3003无论在体外还是体内都可以有效地激活爪蟾PPARγ，并证明了激活PPARγ是导致TPT和UVI3003在爪蟾胚胎体内引起相似畸形表型的潜在机制。此外，项目还开展了五种RXR、RAR、PPARγ配体对爪蟾胚胎作用的基因表达谱和UVI3003对斑马鱼胚胎蛋白组的比较研究，筛选出了大量的敏感作用基因，为运用两栖类动物胚胎筛选核受体干扰物提供了丰富的分子标记物指标数据。在爪蟾PPARγ基因功能研究过程中发现，PPARγ主要作用的靶器官为眼睛，过表达引起的眼睛变小可以在TPT暴露后得到拯救；PPARγ基因敲落具有很强的致畸性，在20 μgSn/L TPT暴露后，死亡率明显增加。以上结果在敏感基因PPARγ对TPT暴露的响应与胚胎眼睛畸形表型特征之间建立了联系。本课题建立了基于表型的胚胎畸形分级方法和敏感时间窗筛选方法，提出了RXR高选择性抑制剂UVI3003同时是PPARγ核受体激动剂的新观点，揭示了三苯基锡和UVI3003对热带爪蟾胚胎的致畸机制。