水稻温控叶色发育调节基因TLC1的克隆与作用机理研究

EMS诱变优良籼型水稻恢复系缙恢10号，获得了一个全生育期受温度调控的叶色突变体tlc1。温度越低,变异越严重：恒温条件下,从低到高依次为白化、黄化、黄绿和淡绿；高低温交替培养，同一叶片即呈现白化至淡绿的连续变化。叶绿素含量与叶色变化呈现极显著正相关，荧光动力学参数qP、Y、ETR和Fo等则明显下降，表明tlc1是一个受温度胁迫的温感突变体,且光合系统受到了影响，类似突变尚未见在水稻中报道。精细定位表明TLC1是一个功能尚未研究的基因。本项目拟图位克隆TLC1，并利用细胞学、蛋白质组学、分子生物学等多种技术手段研究其功能和作用机理。结果不仅为高等植物叶绿体发育、质核信号传导途径、植物对温度胁迫响应机制等研究提供了理论基础，而且为耐低温育种提供了基因资源，具有重要的理论意义和应用价值。

EMS诱变获得一个温度响应型叶色突变体tlc1，在田间种植或变温条件下，同一张叶片表现为黄白和浅绿色，但在20℃、25℃和30℃恒温条件下，其叶色分别表现为黄白化、黄绿和浅绿。透射电镜观察发现，tlc1在20℃时叶绿体发育严重受阻，大多处于质体状态，但在30℃的条件下，已形成了基质片层，而野生型在20℃和30℃均发育出了完整的叶绿体结构。突变体tlc1中的叶绿素荧光动力学参数Fo、实际光化学量子产量Y和光合电子传递速率ETR均极显著低于野生型，Fv/Fm 和Pn则仅在黄化叶中极显著下降，暗示TLC1功能缺失影响了光电子传递效率和PSⅡ中心光化学反应效率。蓝绿温和电泳表明突变体中的PSⅠ、PSⅡ和捕光天线核心复合体含量均显著低于野生型，但PSⅡ和类囊体膜蛋白含量下降最为明显，免疫印记进一步验证了这一结果，LHCⅡB1、 LHCⅡB4、LHCⅡB6和RBCL均极显著降低。双向电泳分析20℃下的叶片总蛋白共鉴定到158个差异点，表达升高或降低的点各有79个，其中，tlc1特异不表达蛋白有12个，特异表达蛋白6个。质谱分析发现差异表达蛋白可分为三类：逆境响应蛋白、氧化胁迫相关蛋白和光合系统蛋白。DAB染色检测发现tlc1中H2O2的含量显著高于野生型。这表明TLC1基因调控水稻光合作用系统并对温度等非生物逆境响应。遗传分析表明，tlc1的突变表型受一对隐性核基因调控，利用西大1A/tlc1和日本晴/tlc1的F2分离群体最终将TLC1限定在水稻第3染色体70.6kb的物理范围内，包含13个功能基因。对这13个基因进行DNA测序，发现仅假定蛋白编码基因在其内含子区域发生了一个G至A的碱基替换，生物信息学分析表明其与CACTA, En/Spm 亚家族转座子蛋白具有较高的同源性。在水稻中，含有2089个CACTA, En/Spm亚家族转座子基因，但其功能均未知。QPCR表达分析发现13个基因中，抗病蛋白 Rps1-k-1编码基因LOC_Os03g37720在20℃表达上调，但测序没有发现碱基差异，互补叶色也没有恢复，但其超表达提高了对水稻纹枯病的抗性，表明其是一个水稻抗病基因，但不是TLC1的目的基因。因此认为，假定蛋白编码基因是TLC1的目的基因，其可能通过温光响应调控叶绿体的发育，从而导致tlc1 的叶色变化。