家蚕卵突变体"明"死卵l-em基因的定位与克隆

家蚕是一种重要经济昆虫和鳞翅目模式昆虫。我们新发现了一种家蚕卵极早期失水致死突变性状"明"死卵，由1个隐性遗传基因（l-em）控制，表现出纯合致死现象，遵循伪母性遗传规律，扫描电镜观察发现突变体卵壳表面出现凹陷处网格皲裂和裂缝。研究内容：针对家蚕"明"死卵突变性状，在经典遗传分析的基础上，利用家蚕高密度SSR分子标记图谱，定位并构建l-em基因SSR分子标记遗传图谱，进一步利用SNP标记图位克隆技术克隆获得l-em基因，结合利用RNA干涉技术进行基因功能验证。预期结果：确定l-em基因所在的连锁群及其座位，克隆获得l-em基因，初步明确家蚕卵突变性状"明"死卵的分子机制。研究结果将有助于家蚕卵壳形成和水分保持的分子机理解析，为蚕种生产防范死卵发生提供理论依据，为鳞翅目农林害虫种群遗传控制技术开发提供靶标基因素材。

家蚕卵壳是覆盖在卵细胞外侧的一层坚固而富有弹性的膜，具有保护胚胎、气体交换和精子入卵等重要生理作用。卵壳结构的破坏会导致胚胎失水死亡，形成死卵。家蚕卵突变体"明"死卵l-em是本研究小组先前发现的一种卵壳突变体，本研究采用图位克隆技术对家蚕卵突变体"明"死卵l-em进行了基因定位，锁定位于第10连锁群卵黄膜蛋白基因BmVMP23和BmEP80为候选基因，对候选基因的表达分析和结构分析表明，在BmVMP23基因终止密码子后的第22个碱基至BmEP80基因ORF的第161个碱基间发生了突变，此区间被约100kb插入片段所替代。经RNAi试验和2DE差异蛋白检测，证实了卵黄膜蛋白BmEP80基因的突变是导致l-em卵突变体产生的主要原因。对正常体和l-em突变体蛹期第6日卵巢的数字基因表达谱分析，两者间存在239个差异表达基因，在l-em突变体中，有182个基因显示上调，57个下调。KEGG路径分析显示，这些差异蛋白分布的5个主要pathway中有3个与蛋白质合成密切相关。研究还发现bmo-miR-1a-3p与BmVMP23基因3' UTR有很好的互补关系，采用过表达该miRNA、人工合成其模拟物（mimic）和抑制物，体外分析其对BmVMP23基因的调控作用，证实bmo-miR-1a-3p能够抑制BmVMP23基因的表达。本研究为阐明“明”死卵突变的分子机制提供了重要的理论依据。