多种植物小肽激素同时富集和纯化新方法的研究

Plant peptide hormones play critical roles in developmental and defense process and their regulation mechanism is becoming a new hotspot in botany. Current plant peptide hormones including four categories and how they interact with each other is an important issue concerned by plant physiologist. Besides genetic and bioinformatic tools, the simultaneous determination of the endogenous level of various plant peptide hormones is also critical to address this issue. Due to the diverse categories and properties of plant peptide, there are lacks of convenient and efficient methods for simultaneous enrichment and purification of different plant peptide hormones, restricting the development of plant peptide hormones analytical technique. To solve these bottleneck problems, in this project, we plan to synthesis a novel polyelectrolyte functionalized magnetic nanoparticles, with the capacity to simultaneously enrich and purify various plant peptide hormones through comprehensive action of reverse phase and ionic interaction. Considering the easy operation of magnetic separation, the pretreatment efficiency will be improved. Combined above-mentioned pretreatment strategy and UPLC-MS detection technique, high-efficient plant peptide hormones analytical method will be constructed. Through the implementation of this project, we hope to provide a key technical support for plant peptide hormones research.

植物小肽激素在调控植物生长发育和抵御外界伤害方面发挥着关键性作用，其调控机制的研究正成为植物研究领域的新热点。目前已发现的植物小肽激素主要分为四类，不同小肽激素之间如何互作是备受植物生理学家关注的重要问题。除了遗传学和分子生物学手段，能够同时分析多种植物小肽激素的内源含量变化也是回答这一问题的关键。由于植物小肽激素种类多，性质差别大，目前尚缺乏简便、高效的多种植物小肽激素同时纯化技术，严重制约了其分析技术的发展。针对这一瓶颈问题，本项目拟设计合成聚电解质修饰的新型磁性纳米材料，利用反相和离子交换的综合作用实现多种小肽激素的同时富集和纯化。同时，借助磁力分离的易操作性，提高样品前处理效率。结合UPLC-MS技术建立高效的植物小肽激素分析方法。希望通过本项目的实施为植物小肽激素的相关研究提供关键技术支持。

植物小肽激素是一系列植物内源信号分子，是植物生长发育和逆境适生不可或缺的调控因子，其生理功能和作用机制研究逐渐成为植物生理学的重要分支。借助于生物信息学和基因组学技术，人们预测植物中存在很多可能的小肽激素，而目前功能明确的仅为系统素、CLE（CLAVATA3/Embryo surrounding region）等数十种小肽激素，尚有大量的未知小肽有待发掘。如何高效的发现、鉴定和分析植物内源小肽激素成为了植物小肽研究的制约性问题之一。围绕这一问题，本项目从植物小肽激素质谱行为与规律、纯化富集新材料的设计两个方面展开了探索。.一方面，在电喷雾电离正离子模式下研究了系统素、CLE40、CLV3等9种典型植物小肽激素的质谱特征及规律，发现其最强准分子离子携带电荷数目与空间分散的碱性酸残基数目具有高度相关性。碰撞诱导解离后，主要在肽键的位置（尤其是脯氨酸/羟基脯氨酸氨基侧及甘氨酸两侧的肽键）发生碎裂产生 b 和 y 型离子。基于 CLE 小肽的保守结构特征及质谱碎裂规律，提出了非数据依赖的 CLE 筛选思路。此外，构建并优化了小肽激素的 LC-MS/MS 方法， 在 0.005~0.2 ng/μL 的线性范围内， 各小肽激素的检出限为0.06~1.1 pg/μL。该工作可为植物小肽激素的结构鉴定与分析提供依据，有望帮助生物学家寻找新的植物小肽激素。 .另一方面，针对植物小肽激素的结构特点，精心设计合成了融合反相、离子交换、磁力分离于一体的新型功能微球，并根据他们的小肽富集行为筛选出了两种合适的功能单体（甲基丙烯酸，MAA；甲基丙烯酸二甲胺乙酯，DMAEMA）。最佳反应条件下，以DMAEMA和MAA为单体合成的微球的有效作用位点分别可达 0.38 mmol/g 和 0.23 mmol/g。利用微球优异的磁性能和良好的小肽吸附能力，本文建立了简便的植物小肽激素富集新方法，成功从加标的植物基质中富集到番茄系统素等植物小肽激素，有望为植物小肽激素间的相关研究提供必要的技术支撑。希望今后的工作能继续沿着高效富集、靶向筛选和综合鉴定的思路继续探索植物小肽激素的分析方法， 以分析技术的突破推进植物小肽激素调控网络的研究。