象草木质素合成关键酶基因CAD的功能鉴定和表达特性研究

Cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) is a key enzyme in lignin biosynthesis, and the content and components would be affected if its activity could be down-regulated and up-regulated. Elephant grass is a kind of important germplasm resources for forage, energy crop and paper pulp, and the quality of them is closely related to the lignin content. In this project, Pennisetum purpureum cv. N51 will be used as the experimental material; gene cloning and bioinformatics analysis of CAD are going to be conducted; RNAi expression vector will be constructed using the Gateway protocol, and employed to silence the expression of CAD gene in elephant grass. At the same time, the over-expression vectors of pBI121-CAD and pCAMBIA2300-Ubi-CAD-ocs will also be constructed, and used for the genetic transformation of Arabidopsis thaliana and rice (Oryza sativa). Finally, the functions of CAD gene are analyzed and concluded by detecting the CAD activity, the lignin content and the ratio of three monolignols (hydroxyphenyl, guaiacyl and syringyl) of transgenic plants. The results not only are beneficial for revelation of molecular mechanisms of lignin biosynthesis, but also extend the molecular biological research foundation of elephant grass, furthermore provide the theoretical guidance for the variety breeding with different purposes such as forage, paper pulp, combustion electricity production, fuel ethanol and biogas fermentation.

肉桂醇脱氢酶（CAD）是木质素生物合成过成中的关键限速酶，下调和上调其活性都会对木质素含量及组分产生重要影响。而象草是热带亚热带地区重要的种质资源，可用作牧草、能源作物和造纸原料，其品质的好坏与木质素含量密切相关。本项目拟以N51象草品种为研究材料，利用Gateway技术构建RNAi表达载体，沉默象草内源CAD基因的表达；同时构建pBI121-CAD和pCAMBIA2300-Ubi-CAD-ocs超表达载体，转化模式植物拟南芥和水稻，进而对转基因植株的木质素含量和3种单体（紫丁香基单体、愈创木基单体和对羟基苯基单体）的组成比例及CAD酶活性加以检测，达到分析CAD基因功能的目的。其研究结果不仅可以拓宽象草分子生物学及木质素生物合成的研究基础，有助于了解CAD基因在分子水平上的调控机制，而且还可为象草饲用、造纸用、燃烧发电用、乙醇生产或沼气发酵用品种的选育提供理论指导。

克隆了象草肉桂醇脱氢酶基因（CAD）及其启动子，并对它们进行了功能分析，以期为象草的木质化改良工作奠定基础。主要结果如下：1）克隆得到PpCAD基因的cDNA序列1342 bp，其中包括1101 bp CDS序列。PpCAD的DNA序列全长为3977 bp，由4个外显子和3个内含子组成。2）软件预测表明，PpCAD蛋白由366个氨基酸构成，分子量38.9 kDa，理论等电点为6.00，没有信号肽，是一个非分泌疏水性蛋白。其氨基酸序列在系统进化树中与单子叶bona fide CAD归为一类。3）用PEG介导法将2个带有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的载体转入象草原生质体，所分离的原生质体可用于基因的瞬时表达。之后构建一个以EGFP为报告基因的亚细胞定位载体pAN580-PpCAD，转化原生质体后发现PpCAD定位在细胞质中。4）构建PpCAD表达载体pBA-PpCAD，转化烟草，得到18个阳性转基因株系。半定量RT-PCR检测6株转基因烟草，发现6株转基因烟草和野生型烟草表型上没有明显差异，除了目的基因多拷贝插入的植株OEC6外，木质素含量有不同程度的提高，最高比野生型提高了56.50%。说明在烟草中过表达PpCAD能够提高植株木质素含量。5）通过hiTAIL-PCR克隆了PpCAD基因ATG上游2054 bp启动子序列，其中TSS上游序列为1898 bp。经过预测，PpCAD基因启动子含有重要的顺式作用元件TATA-box和CAAT-box，具有高等植物启动子的基本特征。构建9个含有PpCAD启动子片段的载体，以GUS为报告基因，转化烟草后进行GUS酶活性测定。结果表明，1154 bp启动子片段的启动效率最高。qPCR检测发现GUS基因在植株不同组织器官的表达量存在差异，1154 bp启动子片段驱动GUS基因的表达模式为：基部茎＞幼茎≈幼叶柄＞成熟叶＞授粉期的花＞花蕾＞成熟叶柄＞根＞幼叶。6）对转基因烟草进行GUS染色后发现，PpCAD启动子能驱动GUS基因在植物的维管组织表达。3月苗龄的烟草不同节间的茎GUS染色存在差异，基部茎的GUS活性要高于顶端幼嫩的茎，说明PpCAD主要参与了植株次生木质部的形成。通过GUS染色差异对比实验，发现PpCAD启动子可以对机械损伤、GA、MeJA和ABA产生响应，与预测结果一致。