人骨髓间充质干细胞和骨膜干细胞成骨化协同机制及构建新骨的动态成骨研究

Research of a high osteogenic potential cellualr resource is a important task for bone tissue engineering, because it is a promising atraumatic therapeutic method for treat critical-sized bone defects. In our early experiments, MSCs(mesenchymal stem cells) isolated from bone marrow and periosteum showed synergetic osteogenic effects in vitro. Based on these findings, and combined with our knowledge in porous bioceramic and metal magnesium alloys scaffolds. In this study, the experimental model of 3-D (three dimensions) culture in vitro, ectopic bone formation, critical-sized bone defects of cancellous bone and cortical bone is established. The in vitro synergetic osteogenic effects and mechanisms of 3-D co-culture hBMSCs (human bone marrow mesenchymal stem cells )and hPCs (human periosteal-derived stem cells) were determined by ALP activity, calcium content, the expression of osteogenic specific micro-RNA, mRNA and protein. For in vivo experiment, the dynamic osteogenesis and central vascularization of co-culture hBMSCs and hPCs were evaluated by histological analysis, imaging evaluation, micro-CT scanning and three dimensions reconstruction. Besides, based on these results, we screening the optimum matching of cellular resources and scaffolds, and discussing the effects of bioceramic and metal magnesium alloys on synergetic osteogenesis of co-culture hBMSCs and hPCs, and then providing theoretical basis for building high efficiency tissue engineering bone.

应用组织工程化骨修复大段骨缺损是未来较有前景的无创治疗策略，研究具有高效成骨性能的种子细胞是骨组织工程研究的重要任务。我们前期研究发现，来源于骨髓及骨膜的间充质干细胞，体外诱导，具有协同成骨的作用。根据这一信息，结合以往我们在生物陶瓷和多孔镁合金材料研究的经验。本课题拟建立体外三维培养、异位成骨、松质骨及皮质骨极量骨缺损等多个研究模型。从ALP活性、细胞钙离子水平、成骨相关mRNA、Micro-RNA及蛋白表达等水平探讨hBMSCs与hPCs在体外三维立体空间的成骨化协同作用及机制。应用组织学、影像学、Micro-CT扫描、微血管固化三维重建等技术，探讨其在体的协同成骨作用，着重研究组织工程骨的动态成骨能力及中心血管化水平。在此基础上，进一步探讨最佳的种子细胞与承载支架组配，以及多孔生物陶瓷和镁合金对共培养hBMSCs与hPCs协同成骨的影响，为构建高效成骨的组织工程化骨提供理论基础。

目的：探讨人骨髓间充质干细胞及干骺端骨膜干细胞成骨化协同作用，以及采用人骨髓间充质干细胞和干骺端骨膜干细胞共培养策略作为骨组织工程种子细胞的可行性。.材料与方法：分离、培养人来源的骨髓间充质干细胞及干骺端骨膜干细胞，通过流式细胞仪及三向诱导进行间充质来源干细胞鉴定。以三种不同比例进行人来源骨髓间充质干细胞及干骺端骨膜干细胞的共培养和成骨诱导，并以同一个体来源的骨髓间充质干细胞和干骺端骨膜干细胞作为平行对照。在体外单层培养水平，通过碱性磷酸酶染色，茜素红染色，测定碱性磷酸酶活性、细胞钙离子水平，应用Real-time PCR检测成骨相关COL1α1、BMP-2、Osteopontin、Osteocalcin的基因表达，探讨人来源骨髓间充质干细胞及干骺端骨膜干细胞的成骨化协同作用。将共培养的人骨髓间充质干细胞及干骺端骨膜干细胞接种β-TCP三维多孔支架，进一步探讨在三维培养条件下，共培养人骨髓间充质干细胞及干骺端骨膜干细胞对成骨相关基因COL1α1、BMP-2、Osteopontin和Osteocalcin mRNA转录的影响。建立裸鼠异位成骨及兔股骨髁松质骨极量骨缺损动物模型，将植入的组织工程骨于不同的时相点取出，通过H&E染色、van Gieson 染色等形态学方法探讨共培养人骨髓间充质干细胞及干骺端骨膜干细胞对在体新骨再生及成熟骨形成的影响，应用vWF免疫组织化学染色，观察共培养人骨髓间充质干细胞及干骺端骨膜干细胞对组织工程化骨新生血管化的影响。.结果： 分离培养的人骨髓间充质干细胞和干骺端骨膜干细胞均具有间充质干细胞的表型特征，具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等细胞系分化的潜能。在体外单层培养水平，与同一个体来源的骨髓间充质干细胞及干骺端骨膜干细胞相比，三组共培养人骨髓间充质干细胞及干骺端骨膜干细胞显著增加细胞碱性磷酸酶活性，促进间充质干细胞的体外成骨矿化，提高细胞钙离子水平。成骨相关基因COL1α1、Osteopontin的mRNA转录开始于成骨诱导早期，而BMP-2 和Osteocalcin基因表达峰值出现在成骨诱导后期。在单层培养水平及三维培养水平，共培养人骨髓间充质干细胞及干骺端骨膜干细胞均在不同时相点上调COL1α1、BMP-2、Osteopontin和Osteocalcin 的基因表达。异位成骨的研究显示，共培养人骨髓间充质干细胞及干骺端骨膜干细胞