基于证-毒-效关联技术辨识麻黄细辛附子汤对心肌线粒体细胞色素C氧化酶调控的非线性生物学靶向特征

Mahuang-Xixin-Fuzi decoction (MXF) is a classical prescription for exogenous disease with kidney yang deficiency, but which has limited clinical application due to toxic herbal components. According to our previous studies and the effect-toxicity theory of traditional Chinese Medicine, we hypothesize that the discrepancy between dose and toxicity is related to the regulation of toxic/effective herbs in MXF on cytochrome C oxidase (Cyt-CO) in cardiomyocytes. Based on the successful mouse model of exogenous fever with kidney yang deficiency, we plan to compare the toxicity in cardiomyocytes of normal and syndrome model mice with the extract of different MXF doses in vitro and in vivo, investigate apoptosis pathway modulated by Cyt-CO in mitochondria, determine the distribution and expression of Cyt-CO with superresolution confocal microspectroscopy, detect the activity of Cyt-CO with histochemistry, test the expression of mRNA and protein of Cyt-C, caspase-3, and etc, and evaluate anti-inflammatory and anti-apoptosis effect involving TLR7 signalling pathway. In terms of syndrome-toxicity-effect combined technique, we strive to unveil the non-linear characteristics of toxicity/effect under the circumstances of different physiological and pathological status and reveal the molecular mechanism of bidirectional regulation of Chinese medicine.

麻黄细辛附子汤（MXF）是治疗肾阳虚外感的经典方剂，但因含有毒性药材极大地影响其在临床使用。基于我们前期研究并根据中医“有故无殒”治法思想推测，MXF在正常、病证结合模型动物上表现出明显的量-毒关系不一致现象是与MXF的毒/效组分对机体心肌细胞线粒体细胞色素C氧化酶（Cyt-CO）调控有关。为了验证假说，在前期成熟的肾阳虚外感小鼠模型基础上，从体外、体内比较MXF不同剂量提取物对正常、病证结合模型小鼠的心肌细胞毒性，研究心肌线粒体Cyt-CO调控的凋亡通路，超分辨共聚焦显微镜检测Cyt-CO分布及表达，采用组织化学法检测Cyt-CO活性、并检测Cyt-C、caspase-3等的mRNA和蛋白表达；同时比较与调控炎症有关先天免疫应答TLR7信号通路的药效变化。基于证-毒-效关联技术，力图揭示MXF多成分在机体不同生理、病理状态下靶向毒性/药效的非线性变化特征和中药复方双向调节作用的分子机制。

麻黄细辛附子汤（MXF）是治疗肾阳虚外感的经典方剂，但因含有毒性药材限制了临床使用。针对MXF中毒-效成分的体内、外药理作用和机制，本研究主要开展了以下三个方面工作：.（1）基于我们前期建立的肾阳虚外感小鼠模型，比较了不同剂量MXF对正常、病证结合模型小鼠的毒-效作用。研究发现，正常组小鼠给与不同剂量MXF后，部分生化指标和炎症因子水平显著升高或降低；不同剂量MXF干预肾阳虚外感小鼠后，可以不同程度的回调模型小鼠紊乱的生化指标和炎症因子水平；提示MXF对肾阳虚外感小鼠生化指标和炎症因子具有良好的改善和回调作用，高剂量MXF对正常小鼠心脏、肝脏、肾脏等有一定毒性。（2）以Cyt-CO、TLR7信号通路作为毒-效研究的靶标，对比研究了MXF对正常和肾阳虚外感小鼠TLRs应答及Cyt-CO介导的心肌细胞凋亡的调控作用。研究发现，随着MXF给药剂量增加，正常小鼠体内Cyt-CO活性逐渐降低，Cyt-C含量增加，凋亡基因Caspase3表达升高，表现出一定的毒性；MXF不同剂量干预肾阳虚外感小鼠后，小鼠肺组织中病毒载量和心脏组织中TLR3、Caspase-3 mRNA表达水平和Cyt-C含量均显著降低，心脏组织中Cyt-CO活性显著升高，推断MXF对流感病毒入侵导致的心肌损伤具有一定的保护作用，可以通过抑制TLRs应答和Cyt-CO介导的凋亡途径发挥药效。（3）为进一步研究MXF对于心肌细胞凋亡的作用机制，开展了基于体外小鼠心肌细胞MCM凋亡模型的MXF干预作用机制研究。利用PCR精确控温系统创新性建立了热刺激诱导小鼠心肌细胞MCM凋亡模型，模拟流感病毒入侵后引起机体发热对心肌的损伤作用。研究发现，MXF对热刺激诱导小鼠心肌细胞MCM凋亡具有一定的保护作用，推测其机制为通过改善线粒体的膜电位值、抑制Cyt C释放，降低促凋亡因子Bax及Caspase-9、Caspase-3/7的表达，上调抗凋亡因子Bcl-2表达，调控线粒体功能，从而有效降低热刺激诱导的小鼠心肌细胞MCM的凋亡百分率。.通过以上体内、体外毒-效作用和机制研究，揭示了MXF在机体不同生理、病理状态下毒性/药效的非线性变化特征和中药复方双向调节作用的科学内涵。