生防假单胞菌Gac/Rsm信号转导系统的自调控机制及其对生防活性的影响

Gac/Rsm signal transduction system, being a global regulatory system, plays an important role in many physiological functions. P. protegens Pf-5, being known for its multiplex biocontrol activities, which can secrete a series of secondary metabolites with biocontrol activity mainly regulated by Gac/Rsm system. Our previous studies indicated that many feedback pathways formed between the components of Gac/Rsm system composed of self-regulatory network in the strain Pf-5. In order to elucidate the auto-regulatory mechanism of Gac/Rsm system, we put forward three hypotheses on the molecular mechanisms of these feedback pathways. Firstly, GacA enhances rsmE expression by RsmA or/and RsmE. Secondly, the self-induction of RsmA is achieved through binding to the 5’ untranslated region of its own mRNA. Thirdly, RsmA/E activate gacS/A expression mediated by ppGpp, and then GacA induces rsmX/Y/Z expression. Based on these hypotheses, a comprehensive and in-depth study on the molecular mechanisms of these feedback pathways will be implemented to clarify the auto-regulatory mechanism of Gac/Rsm system through some techniques such as construction of deletion mutants and complementary strains, construction of lacZ reporter strains, RT-PCR, EMSA assays, analysis of site-directed mutagenesis, and mRNA stability assays. At the same time, we will systematically study the effect of each component of Gac/Rsm signal transduction system on the biocontrol activity of the strain Pf-5 by means of plate antagonism assay, construction of lacZ reporter strains, and RT-PCR. The smooth implementation of this project will provide an explanation for the relative stability of Gac/Rsm system, provide theoretical basis and technical guidance for the construction of the efficient biocontrol agent.

作为全局调控系统，Gac/Rsm信号转导系统在诸多生理功能中发挥着重要调节作用。P. protegens Pf-5以其广谱生防活性而著称，其分泌的一系列具有生防活性的次级代谢产物主要受到该系统的调控。我们前期研究表明，该系统各组份之间形成多条反馈调节通路，进而构成自调控网络。为阐明该系统的自调控机制，我们对这些反馈调节通路的分子机制提出了三条假说。基于这些假说，本项目将通过基因缺失突变菌株及其互补菌株的构建、lacZ报告菌株的构建、RT-PCR、EMSA实验、定点突变分析、mRNA稳定性实验等技术，全面而深入地研究这些反馈调节通路的分子机制，进一步揭示该系统的自调控机制。同时，我们将通过平板拮抗实验、lacZ报告菌株的构建、RT-PCR等技术，系统地研究该系统各组份对菌株生防活性的影响。本项目的顺利实施，将为该系统的相对稳定性提供解释，为高效生防菌的构建提供理论基础和技术指导。

防御假单胞菌Pf-5能够分泌一系列具有生防活性的次级代谢产物，在生物防治和生防菌剂的开发及应用方面具有巨大潜力，但是这些生防活性物质的产量在野生型菌株中通常较低，导致其大规模田间应用效果有限。Gac/Rsm信号转导系统是生防活性物质的主要调控者，因此可以在深入研究该系统的自调控机制基础上，通过针对性破坏其相对稳定性以构建Pf-5衍生的高效生防菌。基于此，本项目以Pf-5作为模式菌株，对Gac/Rsm系统的自调控机制进行了如下研究，即GacA促进rsmE表达的机制研究，RsmA自诱导的机制研究，RsmA/E促进gacS/A、rsmX/Y/Z表达的机制研究，Gac/Rsm系统各组份对生防活性的影响研究。由于基于sacB的无痕基因敲除系统在Pf-5中不能有效发挥作用，因此本项目先期构建了基于upp的高效无痕基因敲除系统。又由于LipA和PueA影响菌株的运动能力和生物膜形成，这与菌株的植物根部定殖有关，因此本项目还开展了ArgR抑制lipA表达的分子机制研究和PueA/B的功能鉴定。研究结果表明，基于upp的无痕基因敲除系统在Pf-5中具有较高效率，并且目标片段长度和敲除效率之间没有明显联系；GacA通过RsmA的介导促进rsmE翻译；RsmA/E可能通过RelA的介导促进gacS/A转录，进而促进rsmX/Y/Z转录；GacS/A、RsmX/Y/Z、ppGpp对Pf-5的生防活性至关重要，而RsmA、RsmE、RelA对Pf-5的生防活性影响不明显；Gac/Rsm系统各组份均促进Pf-5的生物膜形成，而ppGpp对Pf-5生物膜形成的影响具有双重性，在relA-菌株中生物膜的形成受到抑制，而在relA-spoT-菌株中生物膜的形成受到促进；GacS和RsmE抑制Pf-5的运动能力，而其他Gac/Rsm系统组份和ppGpp促进Pf-5的运动能力；ArgR通过结合到PlipA上的ArgR结合位点抑制lipA转录，其中ArgR结合位点上的一致序列TGTCGC对于结合起决定性作用；PueA和PueB属于I.3亚家族脂肪酶，作为Pf-5的主要胞外脂肪酶共同参与油脂摄取，其中PueA起主导性作用，并且AprDEF部分介导PueA和PueB在Pf-5和BL21(DE3)中的胞外分泌。以上研究结果将为Gac/Rsm系统的相对稳定性提供解释，为高效生防菌的构建提供理论基础和技术指导。