Waardenburg 综合征MITF基因c.328T>C突变的分子致病机制研究

MITF gene point mutations were identified in Waardenburg syndrome (WS) type 2 patients, and thought to be disease-causing gene mutations. but the exact molecular pathogenic mechanism is not known. Above all, highly clinically heterogeneous were observed in different individuals, who were identified with identical gene mutations. In this study, we identified a novel mutation c.328T>C (p.Arg110X) of MITF gene in a Chinese pedigree with WS type 2. All the affected individuals manifested a highly phenotypic variations in deafness, abnormal pigment disturbances of skin and hair, and heterochromia irides. Moreover, a single unaffected family member was also detected this mutation. It was deviated from the dominant pathopoiesis of MITF gene. In order to reveal the possible molecular pathogenic mechanism, we will carry out MITF gene c.328T>C mutation screening analysis in WS patients, and analyze the gene expression of MITF and epigenic status in different individuals combined with quantified PCR , immunoblot assay, bisulfite-modification directed PCR product sequencing technique. we will investigate the possible mutation effect of c.328T>C by construction and fuctional study of wild and mutant of MITF gene, and try to interpret the possible pathogenic mechanism of WS.

MITF基因突变与Waardenburg 综合征(WS)密切相关，但其确切的分子致病机制目前尚未阐明，尤其是对携带相同基因突变的不同个体临床表型具有高度异质性的现象目前尚无相关定论。本课题在一中国WS2型家系中首次检测到MITF基因c.328T>C 突变，携带这一突变的个体在耳聋、皮肤及毛发色素分布异常、虹膜异色表型上具有高度的临床异质性，并且还发现了罕见的临床表型正常的携带者，这与MITF基因的显性致病学说相左。为揭示这一现象的内在原因，课题组拟在前期工作的基础上，在中国WS群体中进行MITF基因c.328T>C突变筛查；同时综合运用定量PCR技术、免疫印迹技术、重亚硫酸盐测序技术等手段对MITF基因在家系个体中的表达规律及表观遗传状态进行分析，探讨突变个体间表型异质性的机制；通过构建突变及野生型基因表达载体对MITF基因c.328T>C突变效应进行分析，揭示突变致病的分子机制。

Waardenburg 综合征（Waardenburg syndrome, WS）是综合征型遗传性耳聋临床上常见类型之一，群体患病率为1/42,000～1/20,000，占先天性耳聋的1～3%。本研究利用解放军总医院聋病分子诊断中心建立的聋病资源采集系统，在项目实施期间共收集到新的Waardenburg综合征家系76个，共计96例病例。其中Waardenburg综合征I型家系有7个，共计14例病例，其中有2个或2个以上病例的家系2个，共计9个病例，其余5个均为散发病例；Waardenburg综合征II型家系68个，共计81例患者，其中有2个或2个以上病例的家系有7个，共计37例病例，其余44例为散发病例；Waardenburg综合征IV型家系1例，为散发病例。本课题组未收集到Waardenburg综合征III型病例。这些病例主要来自于全国18个省/直辖市。.我们对68个II型家系的先证者全部进行了针对MITF基因c.328T>C突变的BssS1限制性内切酶酶切分析，发现所有受试者均未检测到MITF基因c.328T>C突变，提示该突变为江西大家系所特有的突变。采集江西家系中的III:18，IV:15、IV:16、IV:21个体的少量皮肤组织，进行黑色素细胞的分离与培养。针对MITF基因c.328T>C突变我们设计了两套TaqMan MGB 探针，分别用两套探针对家系4个个体的黑色素细胞提取的RNA进行实时荧光定量PCR检测，研究发现III:18个体其临床表型特征（包括耳聋及皮肤雀斑程度）在所有4个个体中最轻，其检测到的野生型MITF等位基因转录本较IV:21、IV:15、IV:16明显增多，反之，其检测到的突变型MITF等位基因转录本较IV:15、IV:16明显减少，差异具有统计学意义（p<0.05）。遗憾的是本实验未能采集到家系中相同基因突变携带者IV:23个体的皮肤组织，故对其野生型与突变型MITF蛋白的表达情况无法推算。根据目前的结果推测MITF突变转录本的表达量与疾病的表型程度密切相关，支持野生型MITF 蛋白的单倍剂量不足的致病机制假说。.本实验还成功构建了表达野生型MITF蛋白和突变型MITF蛋白的真核表达载体，转染鼠黑色素瘤细胞B16后发现该载体可以表达出报告基因GFP。该表达载体的构建为进一步研究MITF蛋白下游靶基因的转录活性及表达水平打下良好基础。