腰带长体茧蜂调控寄主昆虫丝氨酸蛋白酶抑制因子（Serpin）的分子机理

本项目以腰带长体茧蜂与亚洲玉米螟为寄生体系，研究寄生蜂寄生对昆虫免疫关键因子Serpin调控的分子机理。拟通过纯化亚洲玉米螟幼虫血淋巴中Serpin-5蛋白，制备抗体，Western杂交及免疫电镜检测Serpin-5在寄生蜂和寄主中组织分布，分析寄生蜂是否直接在蛋白质水平上调控寄主免疫；通过Serpin-5基因克隆、荧光定量PCR、原位杂交、RNAi、免疫电镜、间接免疫荧光和酶学实验检测被寄生后寄主昆虫Serpin-5基因在转录和翻译水平上差异；通过RCL区域定点突变研究Serpin-5结构和功能；通过双向电泳、DIGE和质谱在蛋白质组学水平上分析寄生及毒液、萼液对寄主幼虫Serpin-5及血淋巴差异蛋白表达的影响。本项研究为探讨寄生蜂与寄主昆虫协同进化关系提供基础，从新的视角深入阐明寄生蜂调控寄主昆虫免疫防御分子机理，为利用转基因技术实现害虫防治寻找优秀靶标基因，具有广阔的应用前景。

本项目以腰带长体茧蜂与亚洲玉米螟为寄生体系，研究寄生蜂寄生对昆虫免疫关键因子Serpin调控的分子机理。通过亚洲玉米螟幼虫serpin基因克隆，原核表达serpin蛋白，制备多克隆抗体。Of-Serpin1的全长为1336 bp（登录号：JX524148），包含一个1188 bp的开放阅读框，一个36 bp的5'非翻译区和一个包含加尾信号的112 bp的3'非翻译区，Of-Serpin1的开放阅读框共编码395个氨基酸残基。Western杂交、免疫电镜、间接免疫荧光检测了Serpin蛋白在寄主中组织分布；间接免疫荧光标记实验可以观察到荧光下各种血细胞中Serpin1蛋白呈现绿色荧光。Western blot实验和胶体金标记免疫电镜实验表明Serpin1在体壁中表达量最高，其次是脂肪体，中肠中最少。通过serpin蛋白对PPO、PAP和其他丝氨酸蛋白酶剪切活性的功能分析，证明了serpin1参与了对PPO激活系统的调控。通过2种细菌注射后不同时间不同组织中serpin基因表达量的荧光定量PCR检测分析、RNAi和酶学实验检测了Serpin基因在转录和翻译水平上差异；注射大肠杆菌后，亚洲玉米螟幼虫的4个组织当中Of-Serpin1基因的表达量均出现下调，经过一段时间后才恢复或超过正常水平。注射枯草芽孢杆菌后，除中肠中Of-Serpin1基因处于表达上调状态，其余三个组织中该基因表达量也处于下调状态。总体来说不同组织Of-Serpin1基因对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的反应速度以及受到挑战后表达量的变化存在差别，但是两种细菌都能够引起Of-Serpin1基因在转录水平上的表达量变化。通过对serpin的RCL区域定点突变研究了Serpin1的结构和P1P1`位点的功能；通过RNA深度测序的转录组分析研究了被腰带长体茧蜂寄生后2 h、24 h和48 h昆虫免疫相关基因的表达变化情况。通过双向电泳和DIGE在蛋白质组学水平上分析了寄生对寄主幼虫Serpin及血淋巴差异蛋白表达的影响。通过转录组测序研究了不同温度处理对亚洲玉米螟幼虫的免疫生理的影响。本项研究为探讨寄生蜂与寄主昆虫协同进化关系提供基础，有利于阐明寄生蜂调控寄主昆虫免疫防御分子机理，为利用转基因技术实现害虫防治寻找优秀靶标基因，具有广阔的应用前景。