MIF促进肝纤维化发生的作用及分子机制研究

Hepatic stellate cells (HSC) is the key effector cells in the pathogenesis of liver fibrosis, activation of HSC is regulated by many cytokines and signal pathways. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) is an important human multifunctional protein. Our previous study found that MIF was involved in the occurrence and development of chronic hepatitis B (CHB) and liver cirrhosis (HC), may be related to HSC activation. Our preliminary study has shown that MIF expression is significantly associated with the expression of HSC phenotype and liver fibrosis molecules. Further experiments confirmed that MIF expression increases significantly the expression of TGF-β1 and SP1.These findings raised our hypothesis that MIF enhanced the expression of TGF-β1 by promoting the transcriptional level of SP1,and ultimately promote the formation of HSC activation and liver fibrosis.Based on this hypothesis, HSC activation phenotypic, SP1 and TGF-β1 levels will be detected by using of various biological techniques after regulating the expression of MIF. We will validate the MIF/SP1/ TGF-β1 hypothesis on molecular,cell,animal and human tissue levels in our project. The data generated in our project will provide novel theoretical support for the molecular mechanisms of liver fibrosis.

肝星状细胞（HSC）是肝纤维化过程中最关键的效应细胞，其活化受炎症因子和信号通路的调控。巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是人体重要的多效能炎症因子，我们前期研究发现MIF可能通过活化HSC方式参与慢性乙型肝炎（CHB）和乙肝肝硬化（HC）发生和发展。我们预实验结果表明MIF影响HSC的活化表型和肝纤维化相关分子的表达，进一步实验证实上调MIF表达可显著增加SP1和TGF-β1的表达。进而我们提出假设：MIF通过促进SP1的转录水平而增强TGF-β1的表达，最终促进HSC活化和肝纤维化的形成。基于此，本项目拟通过调控MIF的表达，利用各种生物学定量技术，检测HSC活化表型变化、SP1和TGF-β1水平，分别从分子流行病学、细胞、动物及组织水平探讨MIF影响HSC活化的作用，验证MIF/SP1/TGF-β1的机制假设，本项目的完成将为肝纤维化发生的分子机制提供新理论支持。

目前肝纤维化发病机制能不完全明确；肝星状细胞（HSC）是肝纤维化过程中最关键的效应细胞，其活化受炎症因子和信号通路的调控。巨噬细胞移动抑制因子（MIF）是人体重要的多效能炎症因子，我们前期研究发现MIF可能通过活化HSC方式参与慢性乙型肝炎（CHB）和乙肝肝硬化（HC）发生和发展。本项目通过调控MIF的表达，利用不同生物学定量技术，检测HSC活化表型变化、SP1和TGF-β1水平，分别从分子流行病学、细胞、动物及组织水平探讨MIF影响HSC活化的作用，验证MIF/SP1/TGF-β1通路活化HSC的机制假设。我们对乙肝肝硬化患者肝组织和肝纤维化小鼠肝组织中进行免疫组织化学染色，观察发现MIF、SP1和TGF-β1均表达升高；患者血清中ELISA和WB检测同样得到验证。用TGF-β1刺激人肝星状细胞细胞LX-2，MIF、SP1与α-SMA等mRNA水平和蛋白水平表达均升高，MMP-2酶活性也随着TGF-β1浓度的增加而增强。在小鼠原代肝星状细胞实验中，同样发现TGF-β1的刺激可以使MIF、SP1和α-SMA等表达升高。转染含MIF基因的质粒后，RT-PCR检测发现MIF mRNA表达明显升高，同时α-SMA、TGF-β1、TIMP-1等的mRNA水平有明显上调。但是并未发现SP1 mRNA表达水平的升高。转染含SP1的基因质粒后，RT-PCR检测发现SP1 mRNA表达明显升高，α-SMA、TGF-β1、TIMP-1等的mRNA水平有明显上调；MIF mRNA表达水平并无变化。应用MIF抗体通过尾静脉注射肝纤维化小鼠模型后，取肝脏组织HE染色和免疫组化，结果显示α-SMA等阳性细胞减少;RT-PCR进一步检测显示肝组织α-SMA、α1(I)collagen、 TIMP-1水平降低。我们发现了MIF可无需通过激活SP1而经TGF-β1信号通路实现肝星状细胞活化及肝纤维化发生。本项目验证了课题申请时提出的MIF通过TGF-β1信号通路参与肝纤维化发生和发展；阐明了MIF可以不通过SP1激活TGF-β1信号通路激活肝星状细胞，进而上调细胞外基质表达，促进肝纤维化的发生发展。