α7nAChR作为石杉碱甲(HupA)治疗脓毒症药理作用新靶点的研究

Sepsis is currently the leading cause of death in ICU patients. It is an imperative challenge to find the effective measure for treating sepsis. Previous studies have shown that HupA, which used to treat AD, can significantly improve the survival rate of septic mice, the mechanism of treatment is related to the activation of α7nAChR-JAK/STAT3 signaling pathway, and the reduction of nuclear import of NF-κB and inhibition of inflammatory cytokines, however, anti-inflammatory effects reversed by α-BGT, which is the α7nAChR specific antagonist. Therefore, we hypothesized that HupA exerts the therapeutic effect of sepsis by activating the cholinergic anti-inflammatory pathway via the α7nAChR receptor. This project intends to conduct the following studies: (1) To determine the therapeutic effect of HupA in three sepsis mouse models; (2) To explore differentially expressed cytokines and predict signaling pathways involved in HupA-mediated protective functions by microarray and the bioinformatics analyses; (3) To reveal the molecular mechanism of HupA by addressing whether HupA treatment of septic mice is mediated by α7nAChR by using the CRISPR-Cas9 gene editing technology and α7nAChR knockout mice. The study will provide an important theoretical and experimental basis for the “New Uses of Old Drugs” of HupA.

脓毒症目前是ICU患者主要的死亡原因，寻找治疗脓毒症药物的研究一直是危重病研究的热点。前期研究表明用于治疗AD的HupA可显著提高脓毒症小鼠的存活率，治疗机制与激活α7nAChR信号通路，抑制炎症因子表达有关；同时，抗炎作用可被α7nAChR特异性拮抗剂α-BGT逆转。因此，我们提出了一个假设：HupA通过α7nAChR受体激活胆碱能抗炎通路，发挥脓毒症治疗作用。本项目拟进行以下研究：（1）利用三种脓毒症小鼠模型确定治疗效果；（2）利用蛋白芯片筛选差异表达的细胞因子，生物信息学分析预测信号通路；（3）利用CRISPR-Cas9基因编辑技术和α7nAChR基因敲除小鼠，从细胞和动物两个方面求证HupA对脓毒症小鼠的治疗是否由α7nAChR介导。本项目的意义在于阐明HupA通过α7nAChR介导发挥治疗脓毒症的分子机制，为HupA的“老药新用”提供重要的理论和实验依据，为其临床应用奠定基础。

提高存活率是脓毒症药物研究的难点，控制炎症是提高存活率的关键之一。石杉碱甲（HupA）是从蕨类植物蛇足石杉中分离出的一种生物碱，是CFDA批准临床用于治疗阿尔茨海默症（AD）一类乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChEI），可增进神经递质乙酰胆碱能（ACh）的累积，增强认知功能。本研究利用LPS诱导的脓毒症小鼠模型和CLP脓毒症小鼠模型验证了HupA对脓毒症治疗效果；同时，结合生物信息学手段分析预测HupA调控的信号通路，并在通过体外内实验完成预测结果的验证。在细胞水平上，采用α7nAChR的激动剂尼古丁（Nicotine）和α7nAChR的特异性拮抗剂银环蛇毒素（α-BGT）处理，结果表明HupA通过α7nAChR介导抑制由LPS诱导的NF-κB信号通路中p-IκBα的磷酸化水平（P<0.05），有效抑制核转录因子NF-κB的入核，有效抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的释放（P<0.05），初步验证了HupA通过α7nAChR介导抗炎作用的分子机制。在此基础上，利用野生型小鼠（WT）和α7nAChR基因敲除小鼠，对比HupA在WT和α7nAChR基因敲除小鼠的治疗效果，证实α7nAChR受体在HupA治疗脓毒症中发挥重要功能，显著调控生存率表型。经细胞和动物实验证实HupA通过α7nAChR受体发挥治疗脓毒症作用的分子机制。实验结果解析α7nAChR在HupA治疗脓毒症中的功能地位，研究将提升人们对HupA参与机体免疫的认识，为HupA“老药新用”提供重要的理论和实验依据，为临床应用奠定基础。