非梗阻性无精症患者易感基因SOX5突变筛查及其生精障碍机制研究

Non-obstructive azoospermia is a clinical common disorder of male infertility. Our previous study strongly supported that rs10842262 in the SOX5 gene was significantly associated with NOA. However, the NOA-risk loci identified by GWASs are high-frequency or common variants, but the low-frequency or rare variants in susceptible areas was missed which may also affect the risk of NOA. Furthermore, due to the highly genetic heterogeneity existed among NOA patients with variable degrees of disorder of testis spermatogenesis (including sertoli cell-only, maturation arrest, hypospermatogenesis), etiologies of most NOA patients still remain unknown. This project aims to discover more NOA-risk loci for three pathological types of NOA by targeted resequencing susceptible area of SOX5 gene on the Ion Torrent sequencing platform and combining with bioinformatics analysis,Furthermore, with human spermatagonial stem cells or C18-4 cells (mouse spermatogonial stem cells) as the model, overexpression of wild type and mutant SOX5, RT-qPCR, immunocytochemistry, Western blots, and small interference RNAs (siRNAs) will be utilized to determine the pathogenesis of mutant SOX5 and NOA with disorders of spermatogenesis, thus contributing to predicting males who are at high risk of NOA by genetic screening.

非梗阻性无精症（NOA）是临床上一种常见的复杂男性不育疾病。我们前期研究证实SOX5是NOA疾病的重要易感基因。然而，目前GWAS所发现的大多是高频或常见变异，往往忽略了易感区域内低频或罕见变异。不同NOA患者睾丸病理生精障碍程度差异较大，分为三类：唯支持细胞综合症 、成熟阻滞、生精功能低下；故不同NOA的遗传异质性也较高，导致多数NOA患者病因仍不明确。因此，本研究旨在针对上述三类NOA患者，分别采用Ion Torrent二代芯片在SOX5（12p12.1）区域进行靶向深度测序，并结合生物信息学技术分析风险因子。同时，以分离的人睾丸精原细胞或C18-4细胞系（鼠精原干细胞）为模式，采用野生型及突变型SOX5 逆转录病毒转染，及RT-PCR、免疫细胞化学、Western blots、小分子RNA干扰等技术来研究SOX5突变与NOA生精功能障碍的关系，为临床NOA患者遗传筛查提供分子标志物。

本项目据于非梗阻性无精症（NOA）是临床上一种常见的复杂男性不育疾病，致病因素多而不明确，多数由遗传因素所导致。研究发现男性不育中不同睾丸病理类型或生殖细胞类型的致病分子机理不同。本项目旨在通过对病因不明的NOA患者进行病理分类，探讨前期研究发现的SOX5基因突变与不同病理类型无精症之间的关联及其致病机理。在1079例NOA患者和952例健康人群中对SOX5基因风险位点关联性研究发现，rs10842262位点的G、T等位基因在三组不同病理（SCO、MA、HS）类型的患者中的频率分别是763(0.676)和365(0.324)，p=0.0052<0.01；450(0.726)和170(0.274)，p=0.9405>0.05；245(0.598)和165(0.402)，p=1.49e-006<0.001。本研究结果表明SOX5突变与病理类型为SCO和HS的NOA疾病的发病有一定的关系，与MA类型NOA疾病没有关联。进一步研究SOX5在精子发生和男性不育中的作用，我们发现SOX5可表达于精原细胞、精母细胞、精子细胞上，且其表达含量随之增加。NOA患者其SOX5 mRNA和蛋白的表达含量明显低于OA对照组，且S-SOX5特异性表达于精子细胞上。在神经祖细胞中，研究发现SOX5可以下调WNT–β-catenin信号通路，从而促进axin表达而影响细胞发育周期。同时，我们研究发现β-catenin主要表达于精原细胞的细胞膜和细胞质，在所检测的精原细胞肿瘤与间质细胞肿瘤中没有出现异常表达。SOX5转录因子可能通过下调精原细胞中WNT–β-catenin信号通路，从而参与调控生精细胞的发育周期，促进精子发生。本研究初步揭示了不同男性不育患者SOX5易感突变位点，这为男性不育的精细遗传筛查提供了可靠靶标；初步阐述了SOX5在精子发生和男性不育中的作用；这为将来临床上对男性不育的精确诊断和个体化高效治疗研究提供可靠依据。