基于Keap1-Nrf2-ARE信号通路的活性先导化合物的发现及作用机制研究

Modern medicine has proved Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway activated by drugs, can enhance the body's antioxidant capacity, resulting in anti-inflammatory, anti-cancer and neuroprotective effects. Applicant using the antioxidant response element assay (ARE-Luciferase activity) as a screening model, has obtained a pigment, scytonemin with α,β-carbonyl functional group from the extract of cyanobacteria Scytonema sp.. In addition, we have found scytonemin can induce phase 2 enzymes over-expression via Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway. The current proposal is aimed to develop a DAD-HPLC-MS based analytical method, in combination with bioactivity and chemical NMR profiling to quickly isolate the compounds with characteristic functional group, from the extracts of Scytonema sp.and two sponges Dysidea avara and Halichondria sp., collected from the Xisha Islands. For those compounds with inducing activity of Keap1-Nrf2 -ARE signaling pathway, we will use 2D NMR spectroscopic techniques, as well as the chemical derivatization and the computational simulation method, to identify structures and absolute configurations. Based on the results of inducing activity of phase 2 enzymes, we will use the MALDI-TOF/TOF mass spectrometry, and two-dimensional protein gel electrophoresis techniques to identify the modification site of Keap1 with the active compound, as well as to study the cellular mechanism of the hit of antioxidant compound targeting Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway. This research will provide significant knowledge for the development of new anti-inflammatory drugs.

通过药物激活Keap1-Nrf2-ARE信号通路，能够加强机体抗氧化能力，起到抗炎、抗癌等功效。申请者采用化合物特征谱学分析方法，融合活性导向，发现具有α,β-共轭结构分子Scytonemin，能够激活Keap1-Nrf2-ARE通路，诱导二相代谢酶表达，具有显著的体外抗炎活性。本课题拟以抗氧化反应元件荧光素酶活性为指导，利用GSH探针技术结合DAD-HPLC-MS特征谱学分析手段，从蓝藻（Scytonema sp.）、2种海绵Dysidea avara和Halichondria sp.中快速分离Keap1-Nrf2-ARE通路调控化合物；运用现代波谱技术，结合化学衍生及模拟计算方法，确定化合物绝对构型；在诱导二相代谢酶活性筛选基础上，采用高分辨质谱，二维凝胶电泳等蛋白组学技术，确定活性分子与Keap1的作用靶点及调控机制，获得1-2个抗氧化先导化合物。对研发新型抗炎药物具有重要意义。

Keap1-Nrf2-ARE信号通路是细胞抗氧化应答机制中非常重要的调节通路。当细胞在多种氧化因子的刺激作用下，会激活Nrf2/ARE通路，上调核内抗氧化反应元件(ARE)基因的表达, 从而诱导超氧化物歧化酶(SOD)、醇醛酮还原酶1C1(AKR1C1)、血红素氧化酶1(HO-1)等二相代谢酶的表达，减少体内自由基和氧化物质的形成. 药理药化研究表明，通过药物的诱导修饰，激活Nrf2/ARE信号通路，能够加强机体抗氧化能力，起到抗炎，抗癌和神经保护等功效。.本项目以抗氧化反应元件荧光素酶活性为指导，结合DAD-HPLC-MS特征谱学分析方法，对多种海绵，蓝藻及海洋真菌的近百个天然产物进行了追踪，分离，纯化和活性筛选。运用现代波谱技术，结合化学衍生及模拟计算方法，确定了近50个单体化合物（萜醌类,聚酮类,生物碱类）的平面及立体结构。 随后以HaCaT细胞（人源的正常的永生化的皮肤细胞）和肝癌HepG2细胞为研究对象，建立了抗氧化反应元件（ARE）荧光素酶体外筛选模型。对近30个具有α, β-共轭结构的海洋来源天然产物进行了上调Nrf2蛋白和mRNA表达的活性筛选。我们最终筛选出了3个具有显著抗氧化活性的活性先导化合物，编号分别为DA8，DA14，N-Me-trichodermamide B。 进一步通过多种药理学方法，包括CCK-8、western blot、RT-qPCR、细胞转染、免疫荧光、基因芯片等，对其抗氧化作用机制进行了详细的研究。这三个活性先导化合物都能够通过激活HaCaT细胞中的Nrf2/ARE信号通路上调抗氧化代谢酶血红素加氧酶1（HO-1）的表达，从而发挥抗氧化作用。其中DA8，DA14在浓度为10μM时，上调HO-1表达的活性明显强于10μM的目前临床辅助药物萝卜硫素SFN。该研究项目发表SCI论文14篇，申请国家发明专利2个。此研究结果对开发利用海洋资源，研制新型抗氧化药物制剂，预防各类炎症、心脑血管疾病、糖尿病、癌症等具有重要意义。