有氧/厌氧环境下一株多环芳烃降解菌株降解机理的对比研究及其降解效能的优化

At present, in the field of contamination remediation, the needs of the biodegradation mechanism study of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), especially the HMW-PAHs (high molecular weight PAH, a PAH which contains 4 or more benzene rings) are quite urgent. This program study will focus on the metabolic mechanism involved in aerobic/anaerobic BaP biodegradation. The target bacterial strain is an efficient anaerobic Bap degradation bacteria which was isolated from a PAH-degrading soil at Beijing Coking Plant, Beijing. This promising (facultative) anaerobic PAH-degrading bacterial strain (named M.CSW3), was identified belong to Microbacterium sp.and Cellulosimicrobium sp. using 16sRNA gene sequencing. Benzo(a)pyrene （Bap）, a HMW-PAH with the molecular formula C20H12 that consists of five fused benzene rings, is used as the target contaminant. In this study, proteomic techniques (iTRAQ) will use to indicate the key bacteria proteins which are involved in the metabolic mechanism of aerobic/anaerobic BaP degradation; bioinformatics methods will use to identify the proteins function; RT-PCR will use to verify the proteins expression in transcription level; and the BaP degradation pathway will be mapped base on the detected intermediate products using LC/GC-MS integrated with software prediction. Meanwhile, this study will try to construct the stable PAHs engineering bacteria and PAHs high efficient degradation bacteria by environmental biotechnologies, these results will provide technical supports and species resources for the remediation of complex contaminated sites, such as groundwater, black and odorous water, and sediment.

当前在污染修复领域中，对多环芳烃（PAHs）特别是高环芳烃（含有四个及以上苯环结构的芳烃）生物降解机理的研究需求十分迫切。本项目以从北京市焦化厂分离得到的Bap高效（兼性）厌氧降解菌株（经16sRNA鉴定命名为Microbacterium sp. M.CSW3）为靶细胞，以苯并[a]芘（Bap，具有5个苯环结构）为目标污染物，研究Bap需氧/厌氧生物降解机理。项目将运用蛋白质组学技术（如iTRAQ）筛选参与细菌需氧/厌氧降解Bap的关键蛋白，并运用生物信息学技术及逆转录技术确定关键蛋白的功能及其转录水平；此外，LC/GC-MS技术将用于检测降解中间产物并辅助以软件分析绘制Bap需氧/厌氧降解通路，揭示靶细胞需氧/厌氧降解Bap的机理。本项目还将通过环境微生物技术构建稳定降解PAHs的工程菌及PAHs高效降解菌群，为复杂条件的地下水、黑臭水体、底泥等污染场地的工程修复提供技术支持和物种资源。

本项目以苯并芘降解菌微杆菌M.CSW3为研究对象，分别在Bap为唯一碳源及菲、芘、苯并芘混合多环芳烃共代谢条件下低氧培养取样，联合利用蛋白组学iTRAQ技术及代谢组学LC-MS技术对多环芳烃降解过程中的关键蛋白、代谢产物及代谢途径展开研究与分析，旨在了解低氧条件下单一苯并芘及混合PAHs共代谢两种不同条件下的降解机理，为应用微生物修复技术处理多环芳烃污染提供理论基础与实践依据。.利用iTRAQ技术从蛋白组学的角度研究PAHs胁迫条件下降解过程中细菌蛋白的差异表达。KEGG富集分析显示乙苯降解及苯甲酸降解是多环芳烃降解过程中的重要环节。此外，共鉴定到200个差异蛋白，其中两组共有蛋白40个，表现出相同的变化趋势，主要包括ABC转运蛋白、醛脱氢酶、烯酰水合酶等，且降解过程中可能存在乙酸、丙酮酸等中间产物。在PAHs VS Bap组中则鉴定到159个差异蛋白，ABC转运蛋白ATP结合蛋白显著上调，而Clp蛋白酶ClpX、分子伴侣蛋白等应激蛋白下调，说明共代谢条件下，菌株受到的胁迫阻力降低，可能是因为低分子量PAHs的加入为菌株生长提供了更多的选择，使其能够更容易对PAHs进行摄取与降解。利用LC-MS进行代谢组学研究，分析菌株在降解过程中的差异代谢物及代谢通路，统计分析结果表明PAHs胁迫条件下菌体代谢发生显著变化。KEGG富集分析说明糖类代谢、氨基酸合成、磷酸戊糖途径、ABC转运等代谢对于PAHs低氧降解至关重要。差异代谢物分析共检出14种上调代谢物参与Bap降解通路，进一步分析推测Bap共有五种降解途径，且降解过程中有菲的生成。对蛋白组及代谢组结果进行关联分析，结果显示两种胁迫条件下共同富集的通路有代谢途径、不同环境中的微生物代谢、碳代谢、氨基酸的生物合成、糖酵解或糖异生、丙酸代谢、脂肪酸降解等，这些代谢通路可能对于苯并芘降解具有重要作用。.研究丰富了难降解PAHs及混合PAHs共代谢的降解分析，预测了多环芳烃的降解机理及微生物的调控作用，为推动微生物修复的有效调控及实际应用提供支撑。