外周血CD34+细胞促进牵张成骨的实验研究

外周血CD34+细胞作为造血干细胞，经研究具有向成骨细胞分化的特性，具有能促进血管再生和成骨两大特性，粒细胞集落刺激因子可以动员骨髓中大量的CD34+细胞进入外周血，利用这一特点可以分离更多数量的CD34+细胞。牵张成骨作为成熟的颅面外科技术，现在临床应用广泛，但是牵引失败和诸多并发症时有发生，通常都与长达数月的固定期有关。如果能大幅度缩短固定期，可能会提高牵张成骨的作用效能和成功率。因此，本项目的目标就是利用组织工程的技术将外源性干细胞导入，促进成骨。明确外源性CD34+细胞在下颌骨牵张成骨中促进新骨形成的作用并阐明其机理。通过体外分离鉴定CD34+细胞,采用组织工程的技术将细胞与不同的生物载体相结合，直接应用于牵张区，明确CD34+细胞在下颌骨DO中的最佳应用方式，进而为临床上解决下颌骨牵张成骨治疗过程中固定期过长的问题提供一种新的思路。如果获得成功，将具有广阔的应用前景。

外周血CD34+（PB-CD34+）细胞是以造血干细胞（HSC）为主的混合细胞群。近年来，PB-CD34+促进新生血管发生的作用已被多个实验所证实。并且，PB-CD34+细胞还可以向成骨细胞分化并促进新骨的形成。本课题尝试利用PB-CD34+细胞的成骨及成血管特性，促进牵张成骨区的骨生长，从而达到缩短固定期、提高牵张成骨成功率的目的。首先应用流式细胞仪分选兔PB-CD34+细胞；应用密度梯度离心结合贴壁培养法分离骨髓间充质干细胞（BM-MSC），并利用流式细胞技术检测所得细胞的表面分子表达，克隆集落形成、MTT法检测细胞增殖，并进行成骨、成脂及成神经诱导，从而鉴定所得细胞为BM-MSC；然后以直接接触方式对PB-CD34+细胞及BM-MSC进行共培养，建立共培养体系，并检测共培养细胞的构成。我们还对共培养细胞的生物学特性进行分析：检测细胞周期及凋亡，检测细胞体外成骨能力，对细胞进行成膜诱导，将细胞膜片复合HA进行裸鼠体内移植，检测细胞体内成骨能力，以上检测项目均设计与单纯BM-MSC进行比较、对照。进一步，我们建立兔颅骨极限缺损模型。分别利用共培养细胞及单纯BM-MSC细胞膜片复合HA进行修复。术后8周处死动物，分别通过影像学、组织学及分子生物学检测手段比较两种方法的修复效果。最后，我们建立了兔双侧下颌骨牵张成骨实验模型。通过对牵张成骨区域分别注射了BM-MSC悬液及BM-MSC细胞膜片，于注射后3周及6周处死动物并取材，通过影像学、组织学及生物力学等检测手段观察牵张成骨区域新生骨的质量。结果证实，细胞膜片组新生骨的质量较高，应用这种方法可以有效的缩短牵张的固定期，提高牵张成骨的成功率。. 本项目研究内容已顺利完成，已发表相关SCI论文2篇；中文核心期刊论文1篇；培养博士研究生2名。