GrgA在衣原体生长发育过程中的基因转录调控机制的研究

Chlamydiae are widely distributed and have high prevalence in human populations. Although chlamydiae remain sensitive to several classes of antibiotics, antibiotic-resistant variants are reported at times. The identification of chlamydia-specific inhibitory drugs might be clinically significant. GrgA, a chlamydia-specific transcription activator, that plays a critical role in the regulation of chlamydial growth, is a potential therapeutic and/or prophylactic target. Despite its importance, understanding of the control of GrgA on chlamydial growth and development is still limited. In this study, we will identify the promoters that specifically interact with GrgA in vivo to find out the genes that targeted by GrgA using ChIP-exo followed by high throughput DNA sequencing. By using RNA-seq, we will discover the effects of altered GrgA expression and function on chlamydial growth and development and gene expression profiles. Combining ChIP-exo and RNA-seq results, we will figure out the genes that targeted by GrgA directly and indirectly. In addition, we will try to explore the effects of GrgA on transcription initiation and novel molecules that involve in GrgA-regulated events by indentify proteins that bind to GrgA. In this project, we aim at clarifying the molecular mechanism of GrgA underlying the transcriptional regulation of chlamydial growth and development and identifying GrgA-related molecular events that can be used as novol targets for specific anti-chlamydial drugs development.

衣原体感染导致包括性传播疾病和肺炎在内的多种疾病的高发，而传统的抗生素治疗存在潜在的风险，亟需寻找并发现新型抗衣原体特效药物。GrgA是衣原体特有的转录激活因子，在衣原体生长发育周期中扮演着十分重要的角色，是个很好的特异性药物靶标，但其作用机制尚不清楚，阐明GrgA在衣原体生长发育过程中的转录调控机制意义重大。本项目通过ChIP-exo和RNA-seq技术，发现生理状态下GrgA在衣原体生长发育各个时期直接作用的靶基因和能够间接影响的基因图谱，分析GrgA功能变化对衣原体生长发育和基因表达图谱的影响；同时进一步探究GrgA在转录起始复合物中的作用，免疫共沉淀结合质谱技术寻找GrgA的结合蛋白，发现其中参与GrgA转录调控的若干重要功能新分子。本研究有助于阐明GrgA在衣原体生长发育过程中的转录调控机制，发现其中重要的功能分子事件，为发展特异性的抗衣原体药物提供新的靶标。

GrgA（general regulator of genes A）是我们前期发现的衣原体特有的转录激活因子，能够增强σ66依赖性启动子的转录活力，在衣原体生长发育周期中扮演着十分重要的角色。本研究发现，GrgA能够增强σ28依赖性启动子的转录活力，其转录激活能力依赖于GrgA与σ28之间的直接结合；通过构建氨基酸序列缺失蛋白结合体外pulldown实验，发现σ28与GrgA的结合需要完整的σ28蛋白，任何σ28蛋白结构域的缺失都会影响其与GrgA的结合；GrgA与σ28的结合位于其138-165氨基酸序列，这个位点与GrgA的DNA结合位点重合；进一步的研究发现，GrgA 138-165氨基酸序列7aa缺失不会影响它与σ28的结合，也不会影响它与DNA的结合，但是会严重干扰GrgA对σ28依赖性启动子的转录激活能力；GrgA 138-158氨基酸序列为helix结构，该序列的部分缺失也不会影响它与DNA的结合，但同样会严重干扰GrgA对σ28依赖性启动子的转录激活能力，这些结果都表明完整的138-165氨基酸序列是维持GrgA转录激活能力所必须的。本研究还发现，GrgA与cRNAP（chlamydial RNAP） 核心酶α和β'亚基之间有直接结合，GrgA上可能存在多个α和β'的结合位点；α与GrgA的结合位于其N端1-235氨基酸序列；β'与GrgA的结合位于其N端的1-417氨基酸序列，进一步的研究发现，该序列中存在独立的1-180和241-417两个GrgA结合位点。为了进一步在功能上分析GrgA与α和β'结合位点在其转录调控过程中的作用，首次尝试以体外重组的方法构建重组cRNAP，获得了野生型和α-CTD结构域缺失的重组cRNAP，为研究cRNAP参与的转录调控过程提供了基础。本研究首次发现σ28、α和β'这些参与GrgA转录调控的重要功能分子，丰富了GrgA转录调控过程的认识，为衣原体转录调控机制的研究提供了新思路。