调控山羊卵巢雌激素和孕酮的相关miRNA的鉴定及作用机制研究

The project is to study the genetic regulation mechanism of livestock reproductive endocrine based on the relationship between miRNA and ovarian estrogen and progesterone secretion regulation, using Huanghuai goat as test object. As the main line of study on the identification and function of miRNAs in goat estrogen and progesterone regulation, the project is to identify the miRNAs expression profiling and difference between goat ovaries of the follicular phase and the luteal phase by the high-throughput sequencing technology, firstly. Secondly, the co-expressed profiling of target miRNAs and candidate genes of reproductive traits are all analyzed in goat ovaries by quantitative PCR to find the evidence for interactions between miRNAs and target genes. Finally, the project is to study the molecule mechanism of miRNAs in estrogen and progesterone regulation by ovarian granulosa and lutein cells cultured in vitro, target miRNA mimics and inhibitors synthesis, cell transient transfection, target loci fluorescent reporter vector construction and so on. Results of the project are very important on in-depth understanding of the molecular genetics regulation mechanism of livestock ovarian estrogen and progesterone and will be facilitate people to practice in molecular marker-assisted breeding to improve livestock fecundity.

本项目以山羊为对象，以miRNA与卵巢雌激素和孕酮分泌调控的关系为切入点，研究家畜生殖内分泌分子遗传学调控机制。以鉴定筛选调控山羊卵巢雌激素和孕酮分泌的目标miRNA及其调控分子机理研究为主线，首先采用高通量测序技术，全面鉴定卵泡期和黄体期山羊卵巢组织miRNA表达谱及差异情况，然后采用定量PCR技术检测繁殖性状候选基因和目标miRNA在山羊卵巢组织中的共表达模式，找到目标miRNA和靶基因互作关系的证据；最后通过卵巢颗粒细胞和黄体细胞培养建立体外模型，并合成目标miRNA 模拟物和抑制物，构建靶基因位点荧光报告载体，然后通过细胞瞬时转染，研究miRNA调控雌激素和孕酮作用的分子机理。项目的成果对深入理解家畜卵巢雌激素和孕酮分泌调控的分子遗传学机制以及对提高家畜繁殖力为目标的分子标记辅助育种均具有重要价值。

项目背景:卵巢雌激素和孕酮的周期性变化是雌性发情、排卵、胚胎着床和妊娠等过程必不可少的事件，研究表明，雌激素受体和孕酮受体基因表达受到很多miRNA的调控。因此，寻找雌激素和孕酮分泌调控的相关miRNA及其下游靶基因，并研究目标miRNA与靶基因互作调控激素分泌的机制，对于深入了解哺乳动物的生殖过程以及实现人为的生殖干预均具有重要意义。.研究内容:采用高通量测序技术，鉴定卵泡期和黄体期山羊卵巢组织miRNA表达谱及差异情况，然后采用定量PCR技术检测繁殖性状候选基因和目标miRNA在山羊卵巢组织中的共表达模式，找到目标miRNA和靶基因互作关系的证据；最后通过卵巢颗粒细胞和黄体细胞培养建立体外模型，并合成目标miRNA 模拟物和抑制物，构建靶基因位点荧光报告载体，然后通过细胞瞬时转染，研究miRNA调控雌激素和孕酮作用的分子机理。.重要结果:①测序筛选出了miR-143、let-7b、miR-184、miR-144-3p、novel-miR-159等与山羊卵巢雌激素和孕酮调控相关的miRNAs及其靶基因。②筛选出了FER1L4等12个可能与山羊繁殖有关的基因。③研究结果显示miR-184参与山羊妊娠维持的调控。④FER1L4和SRD5A2基因可能与山羊的高繁殖力相关。⑤测序筛选出let-7b、miR-29c等与安徽白山羊产羔率相关的miRNAs。⑥miR-143可能在卵巢激素分泌与作用应答、妊娠维持等生殖生物学过程中发挥潜在作用。⑦miR-144-3p能够抑制山羊卵巢颗粒细胞增殖、促进细胞的凋亡、抑制山羊卵巢颗粒细胞中雌激素的分泌，但对细胞中孕激素的分泌无显著影响。⑧双荧光素酶报告试验和WB试验结果表明follistatin与miR-144-3p的靶向关系。follistatin对颗粒细胞的作用与miR-144-3p的相反。表明miR-144-3p可以通过介导follistatin基因来调控山羊卵巢颗粒细胞的功能。.科学意义:本项目进行山羊的卵泡期和黄体期的卵巢组织高通量测序，揭示了山羊卵巢的miRNA表达谱、转录组特征及差异表达情况；阐明了miR-144-3p介导follistatin来调控雌激素和孕酮调控的功能。为进一步从分子水平上探索山月卵巢雌激素和孕酮分泌调控的机制、研究哺乳动物生殖调控及分子标记辅助选择提供理论依据。