生物钟CCA1-like基因调控水稻节水抗旱的分子机制研究

The circadian clock exerts a critical role in timing multiple biological processes and stress responses. Based on previous works, we found that two CCA1-like genes OsCCAL1/2 are hub genes of transcription regulatory network and closely associated with drought-tolerance in rice. For OsCCAL1/2, the growth development and physiology and biochemistry will be examined using overexpression and knock-out transgenic plants in order to understand it role on drought-tolerance. In order to find the regulatory network and key gene model about drought tolerance in rice, comparative transcriptome and ChIP-Seq in transgenic plants will be used and to find how to gate the drought stress response. Sequence polymorphism in gene region from rice germplasm resources will be analyzed to look for associated loci with agronomic phenotype under drought stress. Then these loci will be confirmed by yeast-one-hybrid, tobacco transcription activity assay and luciferase report system. The results will reveal the relationship between OsCCAL1/2 and core circadian genes. The expected result will reveal a strategy how circadian gene keep rice fit under drought stress. And it helps us understand the molecular mechanism of rice water-saving and drought-tolerance and provide an important guidance for rice drought-tolerance breeding.

生物钟在调准生物进程和胁迫反应发挥关键作用。基于前期工作，发现2个水稻生物钟CCA1-like基因OsCCAL1/2，与抗旱性紧密关联，属于抗旱转录调控网络的hub基因。本研究拟利用基因过表达和敲除抑制等生物学实验，观察转基因水稻的生长发育和生理生化变化，明确OsCCAL1/2在水稻抗旱中的功能与作用；通过对转基因水稻的转录组比较和ChIP-Seq分析，探明以OsCCAL1/2为核心的调控网络以及所控制水稻抗旱性的重要基因模块，以及如何打开水稻干旱胁迫响应的机制。基因区序列SNP/InDel分析，探寻水稻种质资源中与水稻抗旱系数关联位点，采用Y1H、烟草转录激活活性鉴定和荧光素酶报告系统分析，探析节水抗旱稻品种中核心生物钟基因与OsCCAL1/2相互调控关系。预期结果可以揭示在逆境胁迫下生物钟基因维持水稻健康生长的策略，加深对水稻节水抗旱分子机制的认识，为水稻抗旱育种提供重要的指导参考。

植物生理节律与环境的周期性变化是相互协调的，是植物健康生长发育的基础。但在干旱胁迫下，变化的外界环境严重干扰植物内在的节律。我们利用具有不同抗旱级别的水稻干旱胁迫下转录组学比较分析和关联定位分析，发现2个生物节律相关基因CCA-like 基因OsCCAL1/2，与水稻抗旱性紧密关联，并处于抗旱转录调控网络的关键节点位置。为了更进一步了解相关基因的功能，我们同时克隆了同源的4个OsCCALs，这4个基因对干旱胁迫的节律响应存在相位和峰值差别，亚细胞定位表明是位于细胞核。随后获得了OsCCAL1-4缺失突变体和超表达植株以及OsCCAL1/2双突变材料，20%PEG萌发试验发现超表达转基因植株能增强在渗透胁迫下的萌发率，除了OsCCAL4之外，其它3个突变体削弱了萌发率，双突变体进一步削弱。光照和ABA处理表明OsCCAL1受到光和ABA的调控。驯化单倍型分析发现这4个基因存在明显的籼粳分化，水旱分化不显著，除了OsCCAL2在基因区未发现明显的人工选择，其它3个基因在启动子或基因编码区均存在明显人工选择痕迹，尤其是在现代品种中。通过酵母双杂交筛选获得OsCCAL1互作蛋白CRY和AL7.1，CRY蛋白的互作表明OsCCAL1参与了光信号传导，与AL7.1互作表明OsCCAL1涉及水稻复杂的生长发育调控。AL7.1属于Alfin-like家族的一员，该家族基因的在水稻品种资源中存在多态性，与水稻的抗旱性、种子大小等农艺性状显著关联，驯化单倍型分析发现该家族基因存在明显的籼粳分化，在基因区均存在明显人工选择痕迹，并能挖掘出农艺性状和抗旱性表现较好的单倍型。同时利用OsAL7.1和OsAL11了超表达和敲除突变体材料进一步证实了缺失Alfin-like基因，种子将变大，改变其抗旱性表现和ABA敏感度。此外克隆了来自于苔藓的植物特异性基因PpBURP2，其在水稻中过量表达增强了水稻的抗旱性、抗盐性和耐重金属镉的毒害，并且发现PpBURP2和水稻OsBURP3一样都能与OsMKK1基因互作，表明这是新发现的从低等植物到高度植物都存在的保守的信号传递系统。在本项目研究资助下，共发表了4篇文章，其中top类期刊上2篇，申请或授权专利6项，联合培养硕士研究生3名。