薄皮甜瓜嫁接体砧穗愈合过程的酶和蛋白质组学研究

The grafted cultivation was seriously limited in melon (Cucumis melo L.) plants in practice as the severe problem of graft incompatibility. Three rootstocks with higher graft compatibility for melon plants were bred from more than 100 cucurbitaceous vegetable rootstock germplasms in our previous works. They are named Guazhen No.5 (Cucumis melo L.), Guazhen No.10 (Cucurbita moschata Duch.) and Guazhen No.20 (Benincasa hispida Cogn.), respectively. In this study, we use the muskmelon (Cucumis melo L.) ‘Xin Qingyu’ as the scion and the three gourd vegetables described above as the rootstocks to build three different grafted combinations. The muskmelon ‘Xin Qingyu’ is also grafted onto itself to be the reference. The dynamic changes of histology and cytology are observed during the development of graft-union in different grafted combinations. And the activities and expressions of the enzymes involved in the graft-union development are also analyzed. To find the key proteins acted in the development of graft-union, we use two-dimensional gel electrophoresis combined with mass spectrometry to obtain and identify the different-expressed proteins and/or specific proteins. Moreover, the functions of the specific proteins identified from graft union will be confirmed by the immunologic techniques. This study can provide theoretical guidance for the breeding of rootstock in melon plants. It will promote the use of grafted cultivation in melon plants in practice in future. Finally, this research will offer important clues for the molecular mechanism studies on the graft compatibility in vegetable plants.

针对目前甜瓜嫁接亲和性问题较为突出，严重限制嫁接栽培在甜瓜生产上的推广和应用的问题，本研究采用华南地区主栽的薄皮甜瓜‘新青玉‘为接穗，以本课题组前期筛选和育成的对甜瓜嫁接亲和性较好的甜瓜砧‘瓜砧5号’、南瓜砧‘瓜砧10号’和冬瓜砧‘瓜砧20号’为砧木，组配三种不同的砧木嫁接组合，以自根嫁接薄皮甜瓜为参照，通过观察比较不同嫁接组合砧穗愈合过程组织学和细胞学变化，检测相关酶活性及其同工酶表达，利用双向凝胶电泳结合质谱技术分离和鉴定不同嫁接组合砧穗愈合过程的差异蛋白和特异蛋白，寻找不同嫁接组合砧穗愈合过程中起关键作用的相同特异蛋白，利用免疫技术对部分关键蛋白进行组织学定位和表达分析，深入探讨薄皮甜瓜嫁接体砧穗愈合的蛋白质基础。该研究可为甜瓜砧木育种和嫁接栽培在甜瓜生产上的应用提供理论指导，也可为蔬菜嫁接亲和性的分子机制研究提供重要线索，具有重要的理论价值和应用价值。

针对薄皮甜瓜嫁接体砧穗愈合过程中的酶和蛋白质组研究空白，本研究对本课题组从国内外搜集和保存的不同类型葫芦科蔬菜砧木种质资源与薄皮甜瓜‘青玉甜宝’的嫁接亲和性进行调查，选取亲和性较好的砧木（砧用甜瓜TK、砧用南瓜N10和砧用冬瓜D06，嫁接成活率均高于85.0%）和亲和性较差的砧用瓠瓜H02（嫁接成活率为50.2%），研究嫁接后7d内的组织学变化和砧穗愈合过程中相关酶活性，利用iTRAQ标记对薄皮甜瓜自根嫁接体（C/C）和砧用瓠瓜自根嫁接体（H/H）以及薄皮甜瓜与砧用瓠瓜砧穗嫁接体（C/H）嫁接后第3d和第5d的差异蛋白质组进行了比较研究。结果表明：嫁接后7d内，与嫁接亲和性较好的三种砧木相比，薄皮甜瓜与嫁接亲和性较差的H02嫁接体的砧穗结合部位横切面的组织学结构变化有明显不同，其愈伤组织出现时间较晚，分化的速度慢，隔离层在观察期内始终存在，管状分子分化少、分化速度慢，影响了薄皮甜瓜与砧用瓠瓜H02嫁接体的愈合速度和愈合效果，降低了嫁接成活率。对不同处理砧穗愈合部位SOD、POD、CAT、PAL、CO和PPO等酶活性的研究结果表明，仅POD表现出与薄皮甜瓜嫁接体砧穗愈合有一定的相关性，但其在砧穗愈合过程中的具体作用还需要进一步深入系统的研究。差异蛋白质组学的结果与嫁接后第3d相比，自根嫁接体C/C和H/H分别鉴定到383和416个差异蛋白，而砧穗嫁接体C/H则仅鉴定到239个差异蛋白。对这些差异蛋白质进行代谢通路分析，结果显示涉及核糖体、光合碳固定、光合作用、光合天线色素、氧化磷酸化、丙酮酸代谢、糖酵解/糖原异生途径、柠檬酸代谢（TCA循环）、乙醛酸循环、氨酰-tRNA生物合成等十大代谢通路的差异蛋白质仅在自根嫁接体中出现，涉及这十大代谢通路的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶复合蛋白的E2组分、琥珀酸脱氢酶（辅酶）铁硫蛋白、果糖-二磷酸醛缩酶I类、核酮糖二磷酸羧化酶大亚基、苹果酸脱氢酶等6种酶可能与薄皮甜瓜砧穗愈合密切相关。本研究为蔬菜嫁接体砧穗愈合的分子研究提供候选靶标蛋白，拓展了研究视野。