天冬多糖和精制天冬胶抗肝癌作用及其机理研究

在前期天冬胶抗肿瘤研究的基础上，以提取的天冬多糖和精制天冬胶为治疗药物，作用于体外培养肝癌细胞，及瘤内注射治疗裸鼠皮下移植肝癌和肝动脉灌注栓塞治疗Wistar大鼠肝移植Walker-256癌肉瘤，从细胞生长、肿瘤大小、动物生存等情况，研究天冬多糖和精制天冬胶在体外、体内对肝癌的治疗效果，并用MTT、电镜、流式细胞技术等进一步研究其对于肝癌细胞凋亡的影响、RT-PCR检测bax凋亡基因及bcl-2抗凋亡基因以及免疫组化和Western blot技术选择性检测c-myc、血管内皮细胞生长因子、c-erbB-2、bax蛋白和增殖细胞核抗原等几种与肝癌发病较为密切的基因产物。从动物整体、器官、细胞和基因水平探讨天冬对肝癌的作用及作用机制。通过研究，将本身具有抗肿瘤作用的天冬制成能阻断肿瘤供血的新型抗癌栓塞剂，探讨其有效成分，以提高局部注射给药、经动脉化疗栓塞介入治疗恶性肿瘤机理。

目的：通过体外细胞实验及体内动物实验，探讨天冬多糖及天冬胶对肝癌细胞及肝癌移植瘤的作用和机理。.方法：1.体外培养人正常肝细胞株7702和肝癌细胞株Hep3B、HepG2，以培养基为空白对照、丝裂霉素为阳性对照，用MTT法检测不同浓度的天冬多糖对人肝细胞株生长的影响，绘制量效曲线及生长曲线并计算IC50值；光镜观察细胞形态变化；流式细胞技术检测药物处理48h后的肝癌细胞调亡情况、周期变化。半定量RT-PCR和Western blot检测凋亡相关基因bax、bcl-2、Caspases-3的表达。.2. 体内动物实验中，构建裸鼠高转移性人肝癌细胞HCCLM3皮下移植瘤模型和Walker-256移植性原位肝癌大鼠模型，分别予瘤内注射及肝动脉介入给药，检测血常规,肝肾功能、AFP及病理组织学,免疫组织化学法检测补体C3及MVD等的表达。Western blot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspases-3及血管内皮生长因子VEGF的表达。.结果：1.天冬多糖对人正常肝细胞株7702及人肝癌细胞株Hep3B、HepG2的生长的抑制作用随着浓度的增加(P＜0.05)；与丝裂霉素联合用药具有较好的抑制作用 (P＜0.01)。光镜及流式细胞仪检测显示天冬多糖处理48h后的肝癌细胞Hep3B、HepG2出现细胞凋亡，其凋亡数量随着浓度的升高呈现上升趋势。半定量RT-PCR 及Western blot结果显示天冬多糖具有上调人肝癌细胞凋亡基因bax、caspase-3及下调bcl-2表达水平。.2.实验裸鼠瘤体体积在瘤内注射药物27天后，天冬多糖组、丝裂霉素组和高剂量天冬胶组抑制肿瘤生长的作用明显；丝裂霉素组白蛋白值与天冬多糖组和天冬胶组比较差异具有统计学意义（F=10.563，15.574，P<0.05），天冬多糖组白蛋白值随着用药剂量的升高而升高；高剂量丝裂霉素组裸鼠AFP值明显升高（P<0.05）；高剂量天冬胶组具有升高补体C3的作用（P<0.05）；免疫组化及Western blot结果显示治疗组诱导肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤血管生成作用明显。.3.实验大鼠经肝动脉给药治疗后,丝裂霉素组的白细胞较其他各组低(P<0.05)碘化油组的谷草转氨酶比其他组升高(P<0.05)；天冬多糖和天冬胶组的尿素氮其他组低(P<0.05)。天冬多糖组和天冬胶组的高剂量抑瘤率高。免疫