基于单个金属纳米粒子计数技术均相免疫分析新方法研究

该项目旨基于单个金属纳米粒子计数方法，发展高灵敏的均相免疫新方法，用于肿瘤标志物（大分子）和激素（小分子）检测。单个金属纳米粒子计数的工作原理是基于在聚焦的激光束中，金属纳米粒子（如金和银）由于布朗运动和共振散射效应在检测的微区产生强的光子爆发，光子爆发数与纳米粒子的浓度成正比。我们将优化检测系统，发展数据采集和处理模式，提高单个纳米粒子检测的信/背比和重现性。基于单个纳米颗计数技术，采用夹心模式，构建均相免疫和竞争免疫新方法。发展纳米粒子表面修饰和生物连接方法以及连接物的表征方法，优化免疫反应条件，提高分析方法的可靠性和重现性。将单个纳米颗粒计数方法与生物条形码技术结合，发展超高灵敏的肿瘤标志物分析方法，用于早期肿瘤患者血清中标志物的检测。

单个金属纳米粒子计数原理是基于溶液中单个纳米粒子在高聚焦激光束下由于布朗运动产生强的共振散射光子爆发，光子爆发个数与溶液中纳米粒子个数呈良好的线性关系。 该项目建立了单个金属纳米粒子计数系统，系统研究了光学构型，元件的配置以及收集模式对检测体积的影响。优化了检测系统，减小检测体积，提高了单个纳米颗粒检测的信/噪比。基于检测基线噪声满足高斯分布、纳米粒子光子爆发信号满足泊松分布的特征，发展了光子爆发纳米粒子计数数据处理方法。对光子爆发的强度与相应强度下光子爆发个数作图，得到光子爆发强度与个数的关系，通过曲线拟合确定光子爆发的噪声分布区间及其数学期望μ和方差σ，设定阈值 = μ + 8 × σ。通过软件得到光子爆发峰的个数。此方法显著提高了单个纳米粒子计数方法的重现性。基于光子爆发计数技术，发展了均相免疫分析新方法。分别建立了前列腺特异抗原(PSA)和甲胎蛋白(AFP)的夹心和竞争免疫分析方法。其方法的原理类似于散射相关光谱方法， 采用金纳米粒子标记抗体或抗原。在夹心免疫分析中，抗体与抗原的免疫反应使溶液中GNPs形成二聚或者低聚体，这将导致了溶液中粒子数目减少，从而引起光子爆发数目减少。这一变化可以通过纳米粒子计数技术探测到。我们系统地研究了某些因素对了免疫分析的影响。在优化的条件下，PSA线性范围为1 pmol/L - 10 nmol/L，检测限为1 pmol/L；AFP线性范围为1 pmol/L - 10 nmol/L，检测限为1 pmol/L。该方法成功地用于人血清中PSA和AFP的测定，实验结果与传统的ELISA方法结果基本吻合。该方法的灵敏度高、选择性好、样品处理简单，是一种具有发展潜力的分析检测新方法。