模式斑马鱼微量筛选技术发掘山楂叶中具有显著抗血栓作用的微量先导化合物及其构效关系探讨

Antithrombotic drugs of traditional Chinese medicine become a new opportunity for resisting cardiovascular and blood system diseases, our previous studies have demonstrated that in addition to flavonoids, "monoterpene glycosides" components in hawthorn leaves also has significant antithrombotic effect, and the antithrombotic activity of bioassay-guided "micro components"is stronger than the total extract, compounds and the positive control. In order to explore lead compounds having antithrombotic effect from hawthorn leaf trace components in further research,this project aims to enrich active component by the application of "separation of trace component chromatography",and supplemented by LC/TOFMS molecular characteristics database retrieval method to identify trace components rapidly. At the same time, transgenic zebrafish as antithrombotic models was established for structure-activity relationship study of screening, and evaluation of compounds. Through the above study, obtain antithrombotic compounds have notable activity of novel structure, providing new ideas for specific active components, systems, and efficient separation of discovery, specific categories.

中药抗血栓药物成为抗心脑血管和血液系统疾病治疗的新契机，本课题组前期研究发现山楂叶中除黄酮外"单萜苷类"成分也具有显著的抗血栓作用，并且山楂叶提取物通过活性追踪富集的"微量组分"的抗血栓活性优于总提取物、部分单体化合物及阳性对照药，为从山楂叶微量组分中进一步发掘具有抗血栓作用的先导化合物，本项目拟应用"微量成分色谱分离技术"富集药材中的活性成分，并辅以LC/TOFMS分子特征数据库检索方法快速地识别和鉴定微量成分以指导分离。同时，拟建立以转基因斑马鱼为载体的抗血栓模型用于山楂叶中活性成分的追踪分离，化合物的筛选、评价及构效关系研究。通过以上研究，获得结构新颖的具有良好活性的抗血栓先导化合物，并为特异、系统、高效发现、分离特定类别的活性成分提供新思路。

中药山楂叶及其制剂已广泛地应用于心血管疾病的预防和治疗，其功效与作用物质基础有待进一步深入研究。项目采用活性追踪分离的方式，发现大孔树脂55%乙醇洗脱部位，以及进一步分离得到的聚酰胺水洗及30%乙醇洗脱部位，具有较好的体内外抗血栓作用，大孔树脂55%乙醇洗脱部位也是目前山楂叶制剂所使用的活性部位（如山叶酮胶囊）。进一步地通过活性筛选及HPLC-qTOF液质联用分析，我们发现除黄酮类物质外，山楂叶中“微量单萜苷类、倍半萜类成分”也具显著的抗血栓活性。项目形成了富集、纯化山楂叶中萜类成分的方法，共从山楂叶提取物中分离得到97个单体化合物，通过ADP诱导血小板聚集模型及斑马鱼体内微量模型的建立筛选具有抗血栓作用的活性部分3个，活性单体成分10个（两个模型）。实验中首次利用FeCl3诱导形成荧光标记斑马鱼血栓模型进行抗血栓实验筛选（与山东省科学院合作项目“基于斑马鱼模型的中药心血管活性评价技术与应用”中 本项目研究内容参与获得“山东省科学技术奖二等奖”以及“中华中医药学会科学技术二等奖”）。山楂叶中活性部位及活性单体的抗血栓机制及抑制心血管平滑肌细胞增殖的作用机制的研究，正在与山东省科学院以及日本北海道药科大学相关课题组进行合与研究。同时本项目所采用分离方法已经继续应用得到其他类药材中，并首次在灯盏细辛、山杏叶、紫锥菊中也分离得到具有抗血栓单萜、倍半萜及二萜类成分。项目完善了山楂叶的抗血栓作用物质基础研究，并为特异、系统、富集分离萜类成分提供有效方法。