抗蛋白酶降解的chensinin-1b类肽化合物的设计合成、抗菌活性及其与细胞膜作用机制研究

Antimicrobial peptide chensinin-1b, a designed chensinin-1 analogue, exhibits broad-spectrum antimicrobial activities on both Gram-positive and negative bacteria. It was also found to penetrate mouse skin and be effective in vivo in a wound infection mouse model, the effects of chensinin-1b on wound healing in mice are more significant than the popular commercial product mupirocin ointment. But chensinin-1b is susceptible to trypsin in-vitro which make it as an inferior drug candidate. Peptoids are isomers of peptides where the side chain of each residue stems from the backbone nitrogen instead of the alpha-carbon. This change makes peptoid protease resistant, thereby increasing their bioavailability. In this proposal, series of cationic, amphipathic peptoid and peptide/peptoid hydrids mimics of antimicrobial peptide chensinin-1b are designed and synthesized based on essential biophysical characteristics: charge, hydrophobicity, and amphiphatic organization. The antimicrobial activities and protease resistance of each compound are both examined. The introduce of the monomer with bulky alpha-chiral aliphatic side chain can make the peptoid form poplyproline type-I-like helix part to mimic the alpha-helix part of the parent peptide chensinin-1b, the binding ability of peptoid or peptide/peptoid hybrids with the bacterial membrane and the antimicrobial activities are investigated. The NMR solution structure of the peptoid are studied to confirm the sequence of active site and its structure characteristic. The membrane interaction mechanism of the peptoids are also investigated by varies of biophysics methods. In this proposal, we hope to present an additional stimulus to consideration of these molecules as a new class of therapeutic agents.

抗菌肽chensinin-1b具有良好的广谱抗菌活性，其与细菌细胞膜作用时主要呈现任意伸展的结构，体外酶解实验发现chensinin-1b易于被蛋白酶降解，这影响了其作为抗菌药物在临床上的推广应用。为了提高抗菌肽的蛋白酶稳定性，本研究以具有任意伸展结构的抗菌肽chensinin-1b为模板，通过模拟其阳离子性、疏水性和两亲性，对其肽键骨架结构进行改造，设计合成了系列具有序列特异性的类肽化合物及肽/类肽杂合物，考察其蛋白酶稳定性及抗菌活性；通过引入alpha位具有大空间位阻的手性单体来模拟母体序列中对应螺旋位点的结构，考察其对细胞膜的结合能力和抗菌活性的影响；研究类肽的溶液核磁结构，确定其抗菌活性中心的序列和结构特征；结合生物物理手段探究此类化合物与细菌细胞膜之间的相互作用机制；为此类化合物作为新型抗菌药物的可行性提供理论依据。

抗菌肽chensinin-1b具有良好的广谱抗菌活性，且溶血活性较低，因此chensinin-1b可以作为潜在的抗生素。前期体外酶解实验发现chensinin-1b易于被蛋白酶所降解，因此提高抗菌肽的体内外稳定性成为抗生物在临床上运用之前亟待解决的问题。本研究中，我们利用抗菌肽chensinin-1b在模拟膜环境下的三维结构对其构效关系进行深入研究，结果表明其抗菌活性中心位于序列中第3位Val残基与第13位Arg之间。在此基础上，利用带正电荷残基Lys和Arg取代序列中的His残基得到两种新的抗菌肽[R4,R10]C1b(3-13)和[K4,K10]C1b(3-13)，其螺旋度增加，并且其广谱抗菌活性接近或强于母肽。为了增加chensinin-1b的抗蛋白酶水解活性，我们利用不同长度的脂肪酸对其第17位Lys残基进行修饰，考察了修饰后产物脂肽的生物学功能并考察了其体内稳定性。实验结果表明chensinin-1b脂肽具有与母肽相似的抗菌活性且溶血活性较低，脂肽的抗癌活性及抗炎活性均得到提升。除此之外，脂肽对胰蛋白酶的稳定性以及在小鼠体内的稳定性都有所增强。前期的研究工作表明，D型氨基酸可以提高抗菌肽的稳定性，我们对两种仅含11个氨基酸残基序列的抗菌肽[R4,R10]C1b(3-13) (W3R6)结合酶水解位点的特点进行研究，我们表征了此肽在膜环境下的核磁结构并利用D型精氨酸取代L型抗菌肽中的精氨酸，得到全D型序列vwrrwrrfwrr以及D/L混合型序列VWrrWrrFWrr两种新型W3R6抗菌肽，并对其抗菌活性、体内稳定性和抗菌作用机制进行研究，发现此三种肽都具有抗菌活性，且通过高效液相色谱分析全D型序列可以在胰蛋白酶存在下稳定存在72h，D/L序列在胰蛋白酶作用下可以稳定存在24h。利用Cy7染料标记的抗菌肽W3R6及其改造类似物，发现D型及D/L型类似物均可以在小鼠体内稳定存在12h以上，且不具有溶血活性。通过对chensinin-1b的构效关系分析，以及对合成的系列类似物进行重新改造设计，提高了其抗酶解活性，并对其生物活性进行系列研究，为后续设计以抗菌肽chensinin-1b为模板的新型抗生素药物提供了理论基础。