桃microRNA166调节HD-ZIP III基因参与维管束发育的功能和机理研究

Fruit ventral suture softening during pre-maturation is a serious problem of peach production in China, resulting in reduced market value of the fruit and low economic incomes for growers. Recent studies indicated that the primary feature of suture softening is abnormal development and morphological structure of vascular in the peach fruit. Vascular is the main transport pathway of nutrients, such as water and carbohydrate, in the fruit and other tissues of peach, as well as plays essential roles in the fruit development process and fruit quality. According to the reported multiple regulation functions of microRNAs in aspects of plant growth and development and our recent prediction results through high throughput sequencing, four of the predicted target genes for miR166 were found to encode four proteins in HD-ZIP III subfamily which was widely accepted to take part in the vascular development. In this study, the modes for miR166 in regulation of target genes in HD-ZIP III subfamily will be analyzed through Western blot, qRT-PCR, 5’RACE; In addition, the function of miR166 and target genes in regulation of vascular development will be analyzed by overexpression of miR166 and target genes HD-ZIP III in transgenic tomato. This study will be helpful for illustrating the molecular mechanism of miR166 regulating target genes in HD-ZIP III subfamily in the vascular development, and will deepen our understanding of the reason for the abnormal development and morphological structure of vascular in the future.

果实缝合线软化是我国桃生产中常见的问题，严重地影响桃果实的品质和果农的经济效益。最近研究表明桃果实缝合线软化的形态学表现是维管束生长发育和形态结构异常。维管束是桃果实和其它各组织中水分和糖类等营养物质运输的主要通道，在果实发育和品质形成过程中起着非常重要的作用。鉴于microRNA在植物生长、发育等过程中具有重要调控作用及前期高通量测序预测到桃 miR166的靶基因均编码HD-ZIP III蛋白，本研究拟通过Western杂交、qRT-PCR、5’RACE等分析桃miR166调节HD-ZIP III基因表达的作用方式；通过构建过表达miRNA和靶基因植物表达载体和遗传转化番茄研究miR166调节HD-ZIP III基因进而调控维管束发育的功能。从 miR166 入手研究 miRNA 调控靶基因表达的作用方式进而影响维管束发育的机理，对于解释维管束的生长发育和形态结构异常的原因具有重要意义。

维管束是桃果实和其它各组织中水分和糖类等营养物质运输的主要通道，在果实发育和品质形成过程中起着非常重要的作用。然而有关桃各组织中维管束发育的现有研究主要是电镜等形态学方面的解剖观察和生理方面研究，很少有从分子水平分析桃维管束的生长发育和形态结构的研究。一些文献初步分析miR166 调节 HD-ZIP III参与维管束发育，但是具体如何调节以及影响维管束发育机理还不清楚。本研究旨在从分子水平解析桃miR166 调节HD-ZIP III 亚家族基因表达和影响维管束发育的机理。本研究应用HMM模型确定了桃HD-ZIP 家族含有33个成员，分为4个亚家族，每个亚家族基因成员间在基因和蛋白特性方面都具有高度保守性。其中桃HD-ZIP III 亚家族含有4个成员，小RNA测序发现这4个基因是microRNA166 (miR166) 的预测靶基因。克隆结果获得桃HD-ZIP III 亚家族的4个基因PpHB8、PpHB15、PpREV、PpHB14 的ORF全长分别是2523、2514、2529、2550 bp。桃HD-ZIP III 亚家族的4个成员的结构域组成和排序及三级结构具有高度保守性，而且与HD-ZIP III 亚家族拟南芥相应基因的预测氨基酸序列具有很高相似性。另外发现桃miR166是通过剪切方式调节这4个靶基因 (PpHB14、 PpHB15、 PpHB8、 PpREV) 的表达。桃miR166剪切其相应靶基因的具体位点分别是在靶基因PpHB15、pHB14、PpHB8、PpREV（5’-3’）的第615、589、574、565 碱基处。miR166 调控HD-ZIP III 亚家族基因PpHB15、PpHB14、PpHB8参与维管束发育的功能验证研究已经获得转基因杨树和拟南芥阳性苗，且PpHB15、PpHB14、PpHB8在转基因杨树苗叶片中显著高表达，在对照株中不表达。本研究为进一步继续深入研究miR166调节 HD-Zip Ⅲ调节相关基因参与侧生分生组织（维管束形成层）维持、分化这一条路径的具体调控机理奠定了必要基础。