锌指蛋白ZNF750及其突变体在食管鳞癌细胞上皮间质转化中的作用及机制

Esophageal carcinoma is the fifth-most-common cancer in China，with oesophageal squamous cell carcinoma (ESCC) being the predominant histology. And lack of effective early diagnostic and therapeutic methods leads to a poor prognosis of ESCC patients. Invasion and metastasis are the major causes of death in ESCC patients and epithelial-mesenchymal transition (EMT) plays an important role in invasion and metastasis of cancer. Our previous study of 14 whole genome sequencing and 90 exome sequencing of ESCC showed that ZNF750, a novel member of the zinc-finger transcription factors, harbors significant inactivation mutations. Bioinformatics predicted inactivation of ZNF750 may be a driver event in the development of ESCC. Further studies in vitro showed that ZNF750 may act as a tumor suppressor in ESCC and knockdown or truncating mutations of ZNF750 promote the proliferation, invasion and migration of ESCC cells. Bioinformatics indicated downregulation of ZNF750 is associated with EMT, however, the effect and molecular mechanism of ZNF750 and its mutants in EMT remain unrevealed. This proposal aims to validate the role of ZNF750 and its mutants in the process of EMT in ESCC by cell growth curve, colony formation, transwell invasion assay, zoopery, and further reveal their molecular mechanism in the transcription repression of SNAI1/2，two key EMT transcription factors, by chromatin immunoprecipitation (ChIP), dual-luciferase reporter assay, RNA interference, rescue experiment, immunofluorescence localization and ChIP-sequence. These results will facilitate early diagnosis, prevention, and treatment of ESCC in Chinese population.

食管癌是我国第五大肿瘤，鳞癌是其主要病理类型，由于缺乏有效的早期诊断和治疗方法，预后极差。肿瘤侵袭转移是食管癌患者的主要死因，上皮间质转化是其最重要机制之一。锌指蛋白750是课题组前期对食管鳞癌全基因组及外显子组测序发现的显著突变基因。实验表明ZNF750起抑癌作用，敲除和截断突变显著促进癌细胞增殖、侵袭和迁移。生物信息学提示ZNF750的抑癌作用与EMT相关，但ZNF750及其突变体在食管鳞癌EMT中的作用和机制尚不清楚。本项目拟采用生长曲线、克隆形成、侵袭实验和动物实验等检测ZNF750及其突变体在食管鳞癌EMT中的作用；采用染色质免疫沉淀、双荧光素酶报告实验、RNA干扰、挽救实验等研究ZNF750抑癌作用是否通过转录抑制EMT转录因子SNAI1/2实现，并通过荧光定位、ChIP测序等进一步研究ZNF750突变体的功能，为揭示食管癌新的癌变机理、设计新的抗肿瘤治疗方案提供理论基础。

背景：食管癌是我国第五大肿瘤，鳞癌是其主要病理类型，预后极差。ZNF750是新发现的食管鳞癌显著突变基因，但其功能、机制以及临床意义仍然未知。.研究内容：本项目整合了国内已发表的4个不同项目共计424例食管鳞癌的组学数据分析了ZNF750的突变类型，通过免疫组化分析了308例食管鳞癌标本中ZNF750表达与临床病理因素及预后的关系。通过干扰和过表达ZNF750，以及ZNF750突变体p.S70X和 p.W207X，在细胞水平和动物水平研究了其在食管鳞癌发生发展中的作用，通过PCR array、转录组测序、染色质免疫沉淀、双荧光素酶报告实验等研究了ZNF750可能的分子机制。.结果：1、ZNF750在食管鳞癌中存在高频的失活突变，总突变率 6.37% (27/424), 包括无义突变13/27 (48.1%), 错义突变 11/27 (40.7%), 插入或缺失 3/27 (11.1%)。2、308例食管鳞癌标本的免疫组化结果显示，ZNF750的核/浆比值低与食管鳞癌患者的预后差相关。3、ZNF750抑制肿瘤细胞的侵袭迁移，敲低或过表达ZNF750突变体促进ESCC细胞的恶性表型。4、PCR array显示上皮间质转化（EMT）通路是ZNF750影响的主要通路，其中SNAI1是其主要的下游基因。5、ZNF750可以直接结合到SNAI1启动子区-417 至-410位置，抑制SNAI1启动子活性，从而抑制SNAI1的表达，抑制EMT的发生，而ZNF750的低表达或失活则会促使食管鳞癌细胞发生EMT。对SNAI1进行敲低，则会逆转ZNF750低表达诱导的EMT。6、TCGA肿瘤数据库显示在包括食管鳞癌在内的多种鳞癌中ZNF750与SNAI1的表达呈现显著负相关，ZNF750与上皮标志ECAD正相关。7、转录组测序和ChIP测序筛选到了一批可能的下游靶基因，有待于后续进一步研究。.意义：本项目部分揭示了新的食管鳞癌相关基因ZNF750在食管鳞癌发生发展中的作用和机制，有望为食管鳞癌的精准医疗提供可能的分子标志物和治疗靶