ADAMTS2和ADAMTS4基因对牛前脂肪细胞外基质重构及肌内脂肪沉积的调控研究

The ADAMTSs are new members of metalloprotease,which regulate the remodeling of extracellular matrix(ECM). The ADAMTS2 and ADAMTS2 participate the regulation of intramuscular fat(IMF) in Nanyang cattle. In this study, the cattle adipose-derived stromal cells (ADSCs) will be isolated and induced to adipocyte in vitro. The expression patterns of ADAMTS2 and ADAMTS4 will be analyzed by qRT-PCR during the differentiation of preadipocyte. The nonviral delivery system (CPP-PNA) will be designed and synthesized. The effect of ADAMTS2 and ADAMTS4 RNAi by CPP-PNA during the differentiation of preadipocyte will be analyzed by the following methods: the remoding of extracellular matrix of preadipocyte will be analyzed by laser scanning confocal microscope(LSCM), scanning electron microscope(SEM) and transmission electron microscope(TEM); the lipid deposition will be analyzed by oil red O accumulation in cytoplasm; the expression of key genes, which regulate the cell differentiation, remodeling of extracellular matrix and lipid deposition, will be analyzed by qRT-PCR during the differentiation of preadipocyte. The IMF and muscular histological structure will be analyzed after intramuscular injection of CPP-PNA in vivo. The relationship of extracellular matrix remodeling and cell differentiation, lipid deposition, gene expression profiling of preadipocyte will be revealed and the results could provide new perspectives on the regulation of preadipocyte differentiation and deposition of intramuscular fat in cattle.

ADAMTSs是调控细胞外基质重构的新型金属蛋白酶，前期研究表明，ADAMTS2和ADAMTS4基因与南阳牛肌内脂肪沉积调控有关。本研究拟分离牛脂肪间充质干细胞并进行诱导培养，利用qRT-PCR分析细胞分化过程中ADAMTS2和ADAMTS4基因的表达变化。构建并筛选ADAMTS2和ADAMTS4基因RNAi的CPP-PNA非病毒投送系统，转染牛前脂肪细胞，利用激光共聚焦显微镜、扫描电镜和透射电镜分析RNAi对前脂肪细胞外基质重构的影响；通过油红O 染色分析RNAi对细胞内脂肪沉积的影响；利用qRT-PCR分析RNAi对细胞分化、细胞外基质重构和脂肪沉积关键基因表达的影响；通过肌内注射CPP-PNA进行活体试验，分析RNAi对肌肉组织结构和肌内脂肪的调控作用。本研究将细胞外基质重构与前脂肪细胞的分化、脂肪沉积和基因表达联系起来，为牛前脂肪细胞分化和脂肪沉积的调控研究提供新的思路和依据。

肌内脂肪沉积是牛肉质性状的重要指标，脂肪组织属于疏松结缔组织，含有大量的细胞外基质成分，因此，本研究以调控细胞外基质重构的ADAMTS2和ADAMTS4为候选基因，构建了这两个基因的CPP-PNA载体，在分离的牛前脂肪细胞中进行了RNAi试验。发现ADAMTS2基因的最佳RNAi序列能够使该基因的表达量下降到对照组的51%，蛋白表达量下降到对照组的45%；ADAMTS4基因的最佳RNAi序列能够使该基因的表达量下降到对照组的44%，蛋白表达量下降到对照组的40%。分析了这两个基因在牛前脂肪细胞诱导分化过程中的表达变化情况，发现ADAMTS2基因在诱导分化培养开始后表达量持续上升，在4 d时达到最高峰，之后有所下降；ADAMTS4基因在诱导分化培养开始后也表现出持续的上升，在3 d时达到最高峰，之后下降，但是在第10 d和12 d时表达量又显著上升。ADAMTS2和ADAMTS4蛋白与基因的表达变化具有高度一致性。.ADAMTS2基因RNAi后分析了牛前脂肪细胞中候选基因的表达变化情况，发现编码I型和III胶原的COL1A1和COL3A1基因的表达水平明显下降，但是编码II型胶原的COL2A1基因变化差异不显著。PPARγ和DGAT2基因的表达水平整体上有下降的趋势，导致细胞分化程度和细胞质中脂质沉积均比对照组低。ADAMTS4基因RNAi后分析了牛前脂肪细胞中候选基因的表达变化情况，发现Aggrecan基因表达水平有升高的趋势，其中第1 d和4 d极显著高于对照组； COL1A1和COL3A1基因的表达水平显著升高，而COL2A1基因的表达无显著改变。PPARγ基因的表达水平有下降的趋势，DGAT1和DGAT2基因的表达也呈下降趋势，并且表达高峰比对照组推迟2天左右。FABP3和FABP4基因的表达水平有升高的趋势。最终导致细胞分化程度和脂肪沉积均比对照组低。.分析了ADAMTS4基因RNAi对细胞超微结构的影响，发现处理组细胞质中的脂质液滴边界不清楚，大液滴的数量少，其细胞外基质的厚度大约为0.4~0.7μm，比对照组明显低。MASSON染色后发现ADAMTS2和ADAMTS4基因RNAi均导致脂质液滴周围的蓝色胶原蛋白减少。. 以上分析表明ADAMTS2和ADAMTS4基因RNAi对牛前脂肪细胞的细胞外基质重构和脂质沉积均有重要的影响。