钙内流对电场诱导平曲面上细胞迁移的启动作用

Researches have been found that during fetation and pathology course, such as tissue damage restoring, electric fields play an important role in cell biological behavior. Cell membrane receptors and intracellular signaling pathways and calcium ion are involved. We found that electric fields induce calcium ion colocalize and redistribute asymmetrically. EDTA chelator of calcium ion could inhibit cell migration and morphological change, while inhibition of membrane receptors and intracellular signaling pathways could only abrogate the migration but not the morphological change. So we presumed that the initial point of movement result from the signal of calcium ion. Moreover we improved planar direct current interference device to curved surface which simulated invivo better.To test this assumption, in this project calcium ion, membrane receptors and intracellular signaling pathways will be labelled by fluorescent probe, Immunohistochemistry and fluorescent protein to investigate: 1. the relations of calcium ion, EGFRs, PI3K/PTEN,MAKP and Rho GTPases.2. the relations of calcium ion, calcium channel and cell movement. 3. the relations of calcium ion, cytoskeleton and cell movement. In order to open out the function mechanism of electric fields to cells and make the foundation to apply the electric fields to therapy.

在胚胎发育、组织损伤修复等过程中，内生性电场对细胞运动等行为有广泛影响，细胞膜受体和胞内信号通路以及钙离子均对细胞运动有调控作用。本课题组研究发现电场能诱导细胞内钙离子浓度升高和极化分布，钙离子螯合剂可以抑制电场中细胞运动和形状改变，而膜受体和信号通路的抑制剂只能抑制细胞运动，不能抑制细胞形变。所以我们推测钙内流是电场诱导细胞运动的信号起点。另外还将业内公认的平面作用装置发展成毛细管曲面，更接近机体环境。为了验证钙离子的启动作用，本项目应用上述两种实验装置，结合钙离子和细胞膜受体、细胞内信号通路，采用荧光探针和免疫组化等方法标记胞内与运动相关信号分子，可视化跟踪观察电场作用后：① 钙离子与EGFRs、PI3K、PTEN、MAKP、Rho GTPases和细胞运动的关系。② 钙离子、钙离子通道和细胞运动的关系。③ 钙离子、细胞骨架和细胞运动的关系。为阐明电磁场的治病机理和临床应用奠定基础。

人体中广泛存在一种较长时程的直流电场，在胚胎发育、组织损伤修复和肿瘤转移等过程中，这种电场对细胞生物学行为有着广泛的影响，改变这些正常电场，将导致发育紊乱，损伤修复受阻甚至癌细胞转移。体外培养的神经、上皮和骨骼等多种细胞在电场中发生定向迁移。已经有人将电极植入人体进行损伤的治疗，也有人在组织工程中应用电场诱导细胞迁移生长。但对电场诱导细胞迁移作用机理还不清楚，目前的研究结果集中在细胞膜受体和胞内信号通路发生变化等方面，却不能解释细胞是如何感知微弱的直流电场这一首要问题。.为了研究细胞是如何感知生理电场的，本项目构建了三种电场作用细胞装置，包括：①电场玻璃平面细胞培养装置；②电场毛细管曲面细胞培养装置；③电场聚二甲基硅氧烷平面细胞培养装置。并且优化电场细胞培养装置，省略了银-氯化银参比电极。本项目采用多种脉冲直流电场、连续直流电场和离子交换膜，改变细胞膜上不同钙离子通道的通透性，干扰细胞内的多种信号通路，监控细胞内外钙离子的分布，结合细胞在电场中的运动行为变化，分步骤缩小筛选范围直至发现细胞感知电场的第一物理信号。.我们发现：小鼠成纤维细胞和人前列腺癌细胞PC3①在电场中的向阴极方向定向迁移是钙离子从阳极流向阴极诱发的。②钙离子流是通过钙离子通道中的钙池调控钙离子通道（SOCs）触发细胞定向迁移；③进一步的实验结果证明钙离子流从阳极到阴极穿越细胞触发细胞向阴极定向迁移，其机理为细胞内的钙离子流诱导具有正电性的酪氨酸蛋白激酶（SRC）极化于细胞阴极面，并激活了SRC-PI3K信号通路，诱发细胞向阴极定向迁移。本项目的研究为人们对胚胎发育、组织修复等生理电场中细胞迁移机制的理解奠定基础，为应用直流电场进行疾病治疗提供科学依据。