小鼠胚胎干细胞中Cdk1和Oct4对Cdx2基因表达的调控

胚胎干细胞 (ES细胞) 起源于早期胚胎，其独特之处在于无限期的自我更新能力和产生任何细胞类型的分化潜能，在基础研究和临床医学上具有广泛的应用前景。然而，人们对维持ES细胞生物学特性的分子机制尚缺乏全面深入地了解，这极大限制了ES细胞的有效应用。解决这一问题的途径之一便是发现新的多能性和自我更新能力调控因子并理解其作用机制。最近，我们研究小组证明Cdk1对维持ES细胞的自我更新必不可少，但其调控机制还不清楚。本申请项目将在我们先前的研究基础之上，深入分析Cdk1与Oct4在调控ES细胞分化基因Cdx2转录表达过程中的功能关系，明确Cdk1在维持ES细胞自我更新和抑制细胞分化过程中的作用，期望为ES细胞的应用提供理论线索。

该申请课题所提出的假设是：Cdk1和Oct4结合形成蛋白质复合物，与Cdx2基因相结合，进而抑制Cdx2在ES细胞中的高表达。针对这一假设，我们已经完成工作及成果主要包括以下几方面：一、我们首次通过体内、体外实验证明了Cdk1和Oct4的相互作用。首先，采用过表达的方法进行了免疫共沉淀检测。我们将质粒pcDNAhygro-HA-Cdk1转染ES 细胞，4天后，提取细胞全蛋白进行免疫共沉淀试验。结果成功检测到ES细胞中Cdk1复合物中Oct4蛋白质的存在。同时，我们突变Cdk1的酶突变体，发现该突变并未影响Oct4与Cdk1的相互作用。其次，我们完成了内源Cdk1和Oct4蛋白质相互作用的检测。结果显示：Oct4蛋白质位于Cdk1复合体中。进而，GST pulldown实验证明了Cdk1和Oct4存在直接的相互作用，且该相互作用不依赖于Cdk1的激酶活性。另外，我们证明其它的Cdks不能和Oct4相互作用。我们纯化了GST–Cdk2和GST-Cdk4蛋白质，随后，分别将这些蛋白质和结合到His beads上的Oct4蛋白质孵育，结果发现这两个蛋白质均不能和Oct4相互作用，表明Oct4和Cdk1的相互作用并不普遍存在于Cdk蛋白家族。二、我们首次证明Cdk1通过转录调控机制，促进Oct4转录因子对Cdx2基因活性的抑制。首先，我们证明Cdk1尽管不能和Cdx2启动子直接结合，但却可以加强Oct4与Cdx2启动子的结合。我们纯化了Oct4和Cdk1的蛋白质，通过EMSA检测发现：Cdk1并不能直接与Cdx2启动子结合。然而有趣的是，随着Cdk1蛋白质量的增加，Oct4与Cdx2启动子的结合也随之增加。同时，当我们将Cdk1 knockdown时，Oct4与Cdx2启动子的结合也随之降低。其次，证明Cdk1抑制了Cdx2的基因活性。我们采用调节Cdk1表达水平合并荧光素酶报告基因检测技术的策略。将PGL4-Cdx2启动子质粒分别和Cdk1过表达质粒及Oct4过表达质粒共转染细胞。结果表明Cdk1表达量的提高增加了Oct4对PGL4-Cdx2启动子的抑制。重要的是，kinase-dead突变的Cdk1突变同样增加了Oct4对PGL4-Cdx2启动子的抑制，从而证明Cdk1对Cdx2的转录抑制不依赖于其激酶活性。三、染色质免疫共沉淀技术证明Cdx2为Cdk1的靶基因。