可视化试纸条结合高灵敏度生物发光测序定量检测转基因生物的研究

本课题提出了一种可视化试纸条结合高灵敏度生物发光测序定量检测转基因生物的分析方法。其基本原理是在转基因样本中加入含有来源特异性序列标记的内控核酸，经过无歧视PCR扩增后，使得转基因样本和内控核酸中分别标记上一段来源特异性碱基序列；在一管中同时采用不同抗体标记的引物进行PCR扩增反应；然后将扩增产物点样在试纸条上，通过内控核酸条带的颜色深浅实现对目的基因的半定量检测；再对阳性扩增产物用生物发光焦测序技术进行序列解码分析，根据不同来源碱基的强度比对转基因成分进行准确定量，根据生物发光测序结果对转基因成分进行准确定性。.本课题建立的方法具有以下优点：（1）采用内控核酸，定量性能好；（2）无需荧光标记反应，成本低；（3）测序仪器简单，只需要普通的便携式发光检测仪；（4）对转基因靶标和内控核酸的扩增效率相同无歧视性；（5）适合现场可视化快速检测，操作方便，易于推广和产业化，相关人员无需经过专业培训。

本课题主要针对微量转基因成分（GMO）的检测方法进行研究，分别建立了基于高灵敏度生物发光焦测序的GMO序列测定方法、基于抗原抗体显色反应和核酸杂交技术的可视化试纸条检测的方法、基于侵入分枝滚环扩增技术的信号扩增放大检测微量GMO核酸的方法。在焦测序方法中，根据生物发光原理，研制了小型简易多通道DNA序列分析仪。采用基因工程的方法成功自表达了焦测序反应需要使用四种关键酶：ATP硫酸化酶、荧光素酶、DNA聚合酶和单链结合蛋白（SSB），用于提高测序图谱的质量、提高焦测序的可靠性和稳定性。建立了高灵敏度焦测序体系，可根据生物发光焦测序结果对转基因成分的序列进行准确测定。并对单链测序模板的制备进行了改进，建立了不对称的imLATE-PCR扩增技术和碱基序列标签技术。并针对转基因大豆中含有的CaMV35S启动子、NOS终止子、Lectin基因、35S-CTP4基因和CP4EPSPS基因，转基因玉米中含有的zSSIIb基因、Bt11基因和Bt176基因设计了特异性引物进行检测。在试纸条方法中，设计了含质控线的纳米颗粒可视化试纸条，检测灵敏度可达250 copies/mL。为了避免核酸扩增污染造成假阳性结果，将核酸侵入反应与分枝滚环扩增相偶联建立了新的信号扩增方法，该方法灵敏度高达1 fM，且大大降低了扩增产物交叉污染的风险。. 本课题建立的方法有如下创新点：（1）可检测低至0.01%的GMO成分；（2）采用碱基序列标签取代荧光标记，成本低；（3）测序仪器简单，只需要普通的便携式发光检测仪；（4）对转基因靶标和内控核酸的扩增效率相同无歧视性；（5）适合现场可视化快速检测，操作方便，易于推广和产业化，相关人员无需经过专业培训。. 本课题已发表论文16篇，其中SCI论文8篇（包括Analytical Chemistry 1篇、Biosensors and Bioelectronics 1篇、Chem. Commun. 1篇、Food Chemistry 1篇、Analyst 3篇、J of Nanoscience and Nanotechnology 1篇）；国际会议论文3篇；中文核心期刊5篇。. 本课题的科学意义在于建立了一种高灵敏度生物发光焦测序和可视化试纸条方法准确检测转基因生物（GMO），为GMO的安全控制提供便携式检测方法。