不同来源乳酸菌抗感染特性的比较研究

本项目以内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室从蒙古国和我国内蒙古、新疆、青海等少数民族地区的传统乳制品中分离鉴定的三千多株乳酸菌及内蒙古农业大学兽医学院传染病教研室从北京、内蒙古等地猪和鸡肠道分离的乳酸菌为基础，从中筛选出几株具有较强的耐胆盐和耐酸生长特性、能够耐受人工胃肠消化液等益生特性好的菌株进行乳酸菌体外抗菌特性、体内抑菌特性作用及对肠道菌群影响、对动物肠细胞的粘附特性、饲喂乳酸菌后肠道菌群结构的分子生态学变化及部分体液免疫和细胞免疫变化等进行全面系统的比较研究，从而探明不同来源乳酸菌的抗感染益生特性。.本项目研究对利用乳酸菌制剂，预防和控制人类及畜禽传染病，为人类健康，畜牧业安全生产和推动我国乳品工业的发展具有重大的理论意义和应用价值。

本研究从阿拉善酸驼奶和酸牛奶，内蒙古地区的猪肠道和鸡肠道中采集样品分离得到60多株乳酸菌。通过体外抑菌和耐酸、耐胆盐试验从中筛选出6株益生特性好的乳酸菌（分别命名为LT、LS、LZ1、LZ2、LJ1和LJ2）进行传统表型与生理生化和16S rDNA的鉴定种属。把6株乳酸菌制备成菌悬液，用致病性大肠杆菌K88菌株作为指示菌，把小鼠和仔猪分别分四个不同组饲喂，到10d时分别用致病性大肠杆菌（K88）攻毒,观察和记录小鼠和仔猪的发病和死亡情况。再用6株乳酸菌制备成不同剂量的菌悬液分别饲喂小鼠，用致病性大肠杆菌K88菌株作为指示菌，用ERIC-PCR方法检测6株乳酸菌体内抗感染试验，验证6株乳酸菌对指示菌的抑菌效果。将乳酸菌加入培养的鸡胚肠细胞单层上，用10%的甲醛固定2h，革兰氏染色，镜检，随机挑选20个视野，计数50个细胞上黏附的细菌数，计算每个细胞黏附细菌平均数。用不同剂量的6株乳酸菌灌服小鼠，在不同时间分别用ELISA方法、流式细胞仪和实时荧光定量PCR检测方法测定小鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α的含量及IgG、IgA和肠粘膜SIgA含量变化以及外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD28+ T细胞亚群及CD4+/CD8+比值的变化。.试验结果表明， 6株乳酸菌的传统表型与生理生化鉴定结果和16S rDNA的鉴定结果相一致。6株乳酸菌其代谢产物有较强的抑菌活性，会随着pH值的降低而抑菌活性升高，在胃蛋白酶和胰酶的影响下代谢产物的抑菌活性不受影响，对猪胆盐和牛胆盐也有较强的耐受能力。体内抗感染试验发现，6株乳酸菌对猪和小鼠起到保护作用，并且在停止灌服菌液的第5 d，对致病菌有一定的抑制清除能力。在小鼠的肠道内分离出所饲喂的乳酸菌而分离不出致病性大肠杆菌K88。6株乳酸菌能够粘附鸡的肠细胞；运用ELISA方法和流式细胞仪分析和实时荧光定量PCR检测表明，因灌服菌液的剂量不同、菌液的来源不同和时间的不同都会对小鼠各细胞免疫因子的产生量及T淋巴细胞亚群有着不同的影响，优化CD4+/CD8+比值。.通过本研究发现和证实分离的不同来源的6株乳酸菌具有诸多抗感染及免疫协调作用，这不仅对6株乳酸菌的进一步研究和开发具有重要理论意义，对今后6株乳酸菌应用于预防和控制畜禽传染病，开发乳制品，推动我国乳品工业的发展及在人类健康，畜牧业安全生产等方面具有广阔的应用价值。