原位微量细胞电化学系统检测水中污染物毒性研究

本课题采用鱼细胞系为模型细胞，不经常规的消化、收集、悬浮等过程，建立直接在培养器皿中原位细胞裂解方法；制备对细胞活性标志物有电催化性质的纳米复合微电极和印刷电极，以含有细胞质的细胞裂解液为电化学检测对象，建立细胞活性原位微量电化学检测系统；测定不同污染物作用下鱼细胞系的伏安行为，从核苷酸代谢的角度研究水中污染物对鱼细胞毒性的影响，揭示鱼细胞系的电化学行为与细胞活性关系机理；测定不同种类及浓度的污染物和废水样品对鱼细胞伏安信号的影响，确定相应的剂量-效应关系和时间-效应关系，确定敏感细胞系和最佳测定条件，建立原位微量细胞电化学系统检测水中污染物毒性的方法。为鱼细胞体外电化学检测法替代常规细胞毒性检测法提供实验基础和技术支撑，并为污水处理的安全性评价和水体污染的毒性评价提供一种新的简单、快速、微量、灵敏的检测方法。

与传统体外毒理学评价方法相比，电化学法检测细胞活性是近十年来兴起的新的研究领域，虽然理论和方法还不完善，但凭借其简单、快速、灵敏度高、无毒等特点已成为细胞分析的一个重要研究手段。本项目针对常规细胞电化学检测时细胞前处理过程繁杂、检测样品量较大（不低于500 μL），且该方法尚未用于环境污染物的毒性检测等问题，开展了相应的方法学研究，构建了原位微量细胞电化学检测系统，并用于典型环境污染物的毒性检测。.本项目采用人乳腺癌（MCF-7）细胞和人宫颈癌（HeLa）细胞为模型，省去了常规细胞消化、收集、悬浮等过程，在细胞培养后使用加热灭活等技术在细胞培养器皿中直接裂解细胞，建立了原位细胞裂解方法。对比传统细胞裂解液和原位细胞裂解液的氧化峰电流发现，原位细胞裂解液峰电流比传统细胞裂解液提高43.9%。采用HPLC和化学计量法证明了原位细胞裂解液图谱中两个色谱峰与黄嘌呤和鸟嘌呤一致。采用HPLC对传统和原位细胞裂解液中电活性物质进行分析，发现原位细胞裂解液中鸟嘌呤和黄嘌呤的含量高于传统细胞裂解液。这主要是因为原位细胞裂解简化了操作程序，避免了细胞数量的损失和细胞活性的降低，因此提高了分析方法的灵敏性和分析结果的准确性。.在上述研究的基础上，基于制备的多壁碳纳米管修饰玻碳电极和石墨烯修饰玻碳电极，建立了原位细胞电化学方法，评价了环磷酰胺、五种重金属和三种氯酚类污染物对MCF-7细胞和HeLa细胞的毒性；基于制备的多壁碳纳米管-离子液体修饰玻碳电极和聚罗丹明B/氧化石墨烯/碳纳米管修饰玻碳电极，建立了双信号细胞电化学方法，评价了氯酚类污染物对HeLa细胞的毒性、环境雌激素对MCF-7细胞增殖的影响及重金属对人肝癌（HepG2）细胞的毒性；基于制备的多壁碳纳米管-离子液体修饰玻碳电极，建立了黄嘌呤氧化酶辅助的四信号细胞电化学方法，评价了环磷酰胺对MCF-7细胞增殖的影响；基于制备的苏氨酸修饰铅笔芯微型电极，建立了原位微量细胞电化学检测系统（所需样品量仅10 μL），评价了环磷酰胺对MCF-7细胞增殖的影响。同时，利用常规MTT法证实了所建立的原位细胞电化学法的可靠性。.本项目为细胞体外电化学检测法替代常规细胞毒性检测法提供了实验基础和技术支撑，并为水体污染物毒性评价提供了一种新的简单、快速、微量、灵敏的检测方法。