Notch信号通路在Lmx1α及NTN介导的rBMSCs向多巴胺能神经元样细胞定向分化中的机制研究

Parkinson's disease is mainly due to the damage of dopaminergic neurons in the substantia nigra and can’t produce and store dopamine. Dopaminergic neuron cell transplantation treatment can supplement the lack of dopaminergic neurons and achieve the purpose of treatment. The preliminary results of our research group showed that with the combination of human sonic hedgehog and other inducers, the Lmx1α and NTN gene modified rhesus bone marrow mesenchymal stem cells can successfully trans-differentiation to dopamine neuron like cells in vitro. Although these trans-differentiation dopamine neuron like cells showed activities both in vitro and in vivo, but the specific mechanism during trans-differentiation is not clear. Our study intends to explore the Notch expression regulation and whether there is intermediate cells phase as neural stem cell like cells during trans-differentiation through the dynamic detection of 84 genes and 2 target genes in Notch signal pathway and combined with the corresponding cell phenotypic identification via PCR gene chip method, which is helpful to establish the simple and efficiency method of obtaining dopaminergic neuron like cells, also can provide a reference for the study of PD gene therapy and cell replacement therapy.

帕金森氏病主要是由于黑质多巴胺能神经元受损而不能产生、储存多巴胺。多巴胺能神经元细胞移植治疗可补充缺失的多巴胺能神经元，从源头上达到治疗目的。本研究组前期结果表明，经Lmx1α和NTN基因修饰的恒河猴骨髓间充质干细胞，在重组人源Sonic Hedgehog及其他诱导剂的作用下，能够成功转分化为多巴胺能神经元样细胞，并具有体外特征和体内活性，但诱导过程中具体的转分化机还制尚不明确。本研究拟通过PCR基因芯片的方法定时检测Notch信号通路84个关键基因及2个靶向基因的表达并结合对应时间点的细胞表型鉴定的结果，探究上述转分化过程中是否具有神经干细胞样细胞的中间态细胞和 Notch信号通路的表达调控过程，以有助于探索建立简便、效率的获取多巴胺能神经元样细胞的方法，为PD基因治疗和细胞替代治疗研究提供参考。

项目背景.帕金森氏病主要是由于黑质多巴胺能神经元受损而不能产生、储存多巴胺。多巴胺能神经元细胞移植治疗可补充缺失的多巴胺能神经元，从源头上达到治疗目的。本研究组前期结果表明，经Lmx1α和NTN基因修饰的恒河猴骨髓间充质干细胞，在一定的体外诱导剂的作用下，能够成功地分化为多巴胺能神经元样细胞，并具有体外特征和体内活性，但诱导中具体分化机制尚不明确。.主要研究内容.本项目按照前期工作中方案进行体外诱导，在若干时间点鉴定其细胞表型特征、多巴胺转运体、多巴胺分泌情况及生理电位，并采用 RT2 Profiler PCR技术检测细胞分化过程中Notch信号通路中关键因子的转录情况，监控该信号途径在分化过程中的实时变化，阐明该通路在hBMSCs经由神经干细胞（hNSC）向多巴胺能神经元分化的过程中的改变及作用。.重要结果.①诱导培养21天后，呈神经元形态，表达多巴胺能神经元特异性分子标记物酪氨酸羟化酶（TH）和多巴胺转运体（DAT），且能够分泌多巴胺，神经元兴奋性增强。.②诱导培养14天时，hNSCs细胞特异性分子标记物配对盒基因（Pax6）、性别决定区Y框蛋白1（SOX1）、八聚体集合蛋白（Oct4）表达增多，但在培养21天时，三者表达减少。.③通过RT2 Profiler™ PCR Array方法检测在诱导0天、7天、14天和21天的NOTCH信号通路的基因表达情况，对比差异表达的基因。在诱导7天后， 通路相关的8种基因表达相对于对照组有所差异；诱导14天后，差异表达的基因有20种；诱导21天后，差异表达的基因数量减少为5种。.科学意义.本研究采用RT2 Profiler PC技术对hBMSCs分化多巴胺神经元样过程中Notch信号通路的84个基因进行动态检测，探讨该诱导分化条件下的细胞状态和 Notch 信号通路中关键因子的动态变化以及二者的对应关系，从分子层面验证该体外诱导方案的可行性和有效性，为PD基因治疗和细胞替代治疗研究提供有力的技术支持以及新的治疗靶点，提供了更宽广的思路和实施方案。