基于分子修饰的抗白内障活性霍山石斛多糖的构效关系及作用机理研究

白内障是目前世界上首位致盲眼病，尚无令人满意的治疗方法，寻求有效的抑制或延缓白内障发生、发展的药物，对于解决白内障的防治问题将具有十分重要的意义。药用石斛是我国历代本草记载具有"明目"功能的传统中草药。我们前期研究发现，多糖是药用石斛发挥抗白内障功能的主要活性成分，其中以霍山石斛多糖的效果最好，并从霍山石斛中分离纯化出抗白内障活性多糖单一组分HPS-1B23，阐明了其一级结构。本项目拟以此为基础，以HPS-1B23为起始分子，采用硫酸化和酶解为代表的多糖接枝与降解的分子修饰方法，对其分子结构进行改造，经分离纯化、结构表征和抗白内障活性评价，解析抗白内障活性霍山石斛多糖的构效关系；以晶状体细胞信号转导通路为切入点，研究多糖抗白内障的作用机理。该研究不仅能为揭示多糖抗白内障活性化学结构信息提供科学依据，而且将为深入研究多糖抗白内障的作用机理和定向研制高抗白内障活性多糖类新药奠定理论基础。

本项目采用硫酸化和酶解分子修饰技术，以晶状体细胞信号转导通路为切入点，对抗白内障活性霍山石斛多糖的构效关系与作用机理展开了研究，主要研究结果如下：(1) 利用离子交换色谱、分子截留和分子排阻色谱等分离纯化技术，从霍山石斛总多糖中纯化获得5种多糖均一组分DHPD1、DHP-W1、DHP-W2、DHP-W3和DHPD2，平均分子量分别为3200 Da、22000 Da、73800 Da、1200000 Da和8090000 Da。在此基础上，用多糖甲基化、FT-IR和NMR等技术分析确定了这五种多糖的可能重复结构单元。(2) 活性筛选研究发现，DHPD1、DHP-W1、DHP-W2、DHP-W3和DHPD2具有不同的药理活性。DHPD1、DHP-W2和DHPD2显示出了较强的抗蛋白质糖基化活性，与模型组相比，它们对糖基化终产物（AGEs）的抑制率分别能达到38.4%、24%和35.2%。DHP-W1和DHP-W3具有较强的免疫调节功能。(3) 由于晶状体蛋白糖基化是白内障发生过程中的重要病理特征，所以我们以抗蛋白糖基化活性较强的DHPD1和DHPD2为起始分子，采用多糖硫酸化和酶解分子修饰技术，研究建立了霍山石斛多糖结构与抗白内障活性的构效关系。定位硫酸化修饰和随机硫酸化修饰分析表明，C-2和C-6位-OH被硫酸基团取代能显著提高DHPD1和DHPD2抑制蛋白糖基化的活性，且C-6位-OH被硫酸化取代更有助于多糖抗蛋白糖基化活性的发挥，提示霍山石斛多糖的C-2和C-6位-OH被硫酸基团取代将有助于其增强抗白内障活性。酶解分子修饰研究表明，由→4-α-D-Glcp(1→、α-Glcp(1→、→4,6-α-Glcp(1→、→6-α-Glcp(1→、→3,6-α-D-Manp(1→、→5-α-D-Araf(1→和β-Xylp(1→构成的寡糖片段可能是霍山石斛多糖发挥抗白内障活性所必需的核心结构。（4）晶状体上皮细胞凋亡是白内障发生的主要病理机制之一。研究发现，100 μg/mL的 DHPD1及其酶解产物均能抑制H2O2诱导的HLEC凋亡，但抑制活性随着酶解产物分子量的降低而减弱，这与其下调MAPK和PI3K/Akt信号通路关键蛋白ERK、JNK、p38和Akt的磷酸化密切相关。据此我们推测霍山石斛多糖抑制晶状体上皮细胞凋亡是其干预白内障发生的主要作用机制之一。