ROS/HIF-1α调控NCX1在大鼠逼尿肌过度活动中的作用及机制研究

Detrusor overactivity (DO) which is a research hotspot in the diseases of bladder function. At present, more and more evidence indicated that the spontaneous of detrusor cell was an important mechanism of DO, and calcium ions imbalance played a key role in the regulation of detrusor excitability. Previous reports and our studies have found, the sodium calcium exchanger (NCX) is an important channel to regulate intracellular calcium, play an important role in bladder excitation regulation. In the pre experiment of rat after PBOO, we found that NCX1 expression was significantly increased, stimulated the NCX1 induced abnormal contraction similar to DO. Combined with the past studies, we speculate that NCX1 by controlling the intracelluar of calcium in the detrusor cells, triggered the detrusor excitability abnormality, play an important role in the regulation of DO in rats, and may be affected by the upstream ROS/HIF-1α. This topic with a rat after PBOO to simulate the detrusor overactivity, the calcium measurement, patch clamp, real-time quantitative PCR, verified the function of NCX1 in rat DO. Then, used the gene silencing, CO immunoprecipitation technique to investigate the regulation of NCX1 by ROS/HIF-1α. To elucidate the mechanism and regulation of DO could provide new theory and targets for the prevention and treatment of DO.

逼尿肌过度活动（Detrusor overactivity, DO)是目前膀胱功能疾病中的研究热点。目前研究发现，逼尿肌细胞兴奋性异常是DO发生的重要机制，而钙离子失衡在其中发挥关键作用。文献及我们发现，钠钙交换体（NCX）是调节细胞内钙平衡的重要通道，在膀胱兴奋调控中发挥作用。在大鼠DO预实验中，我们发现NCX1表达显著增高，产生了类似DO的异常收缩。结合文献及实验基础，我们推测NCX1通过控制逼尿肌细胞内的钙离子，引发了逼尿肌细胞兴奋性异常，在大鼠DO中发挥重要作用，并可能受上游ROS/HIF-1α的调控。本课题拟用大鼠膀胱出口部分梗阻模型，通过钙负载、膜片钳、实时定量PCR等技术，验证NCX1在大鼠DO中的作用，进一步通过基因沉默、免疫共沉淀等技术，探索ROS是否通过HIF-1α调控NCX1的作用机制。对阐明DO的发生及发展，有重要意义，为预防和治疗DO提供新的理论和作用靶点。

研究背景：逼尿肌不稳定(detrusor overactivity, DO) 是指在膀胱充盈时自发或诱发的逼尿肌不自主收缩。研究发现在动物和人膀胱平滑肌细胞中细胞内钙离子的失衡，导致的细胞兴奋性增高，是引发逼尿肌过度活动的重要原因。钠钙交换体（NCX是）是细胞膜上维持细胞内钙离子平衡的重要离子通道。我们在PBOO大鼠模型预实验中发现，NCX1表达较对照组明显增高，因此推测，其可能在大鼠模型的逼尿肌异常兴奋中可能发挥重要作用。.研究内容及结果：.第一部分实验：首先利用qRT-PCR, WB和免疫荧光技术检测NCX1在DO大鼠逼尿肌中的表达；其中mRNA表达为对照组的2.43倍，蛋白约1.5倍；接着在肌条测试中，应用NCX的特异阻滞剂，记录到DO组较对照组有更显著的阻滞效果（收缩能力和收缩频率）；进一步利用阻滞剂在钙负载实验和膜片钳实验证实DO组的NCX电流、钙离子浓度、钙闪烁的时间较对照组更高。.意义：NCX1在DO大鼠模型中，升高了逼尿肌细胞内钙离子浓度，提高了逼尿肌自身的兴奋性，为进一步研究其调控机制提供了基础。.第二部分实验：首先利用qRT-PCR, WB，流失细胞仪和免疫荧光技术分别在以下逼尿肌细胞株（H2O2刺激/低氧刺激）、NAC预处理组逼尿肌细胞株（N-acetyl-cysteine，NAC为ROS的阻滞剂，再H2O2刺激/低氧刺激）、逼尿肌细胞株（SiRNA基因沉默HIF-1α，应用DMOG为不产生ROS的HIF-1α激动剂）、对照组逼尿肌细胞株（未基因沉默HIF-1α，应用DMOG）和阴性对照组（无任何刺激）检测ROS、HIF-1α、NCX1在逼尿肌细胞中的表达；进一步利用MTT实验，钙负载和膜片钳检测了以上各组的细胞生长率、胞内钙离子浓度和NCX电流；检测证实ROS通过HIF-1α在DO大鼠逼尿肌细胞中调控NCX1的表达和功能。.意义：证实ROS通过HIF-1α在DO大鼠逼尿肌细胞中调控NCX1的表达和功能，提高了逼尿肌细胞自身兴奋性，也再一次证实ROS的增高是逼尿肌细胞异常兴奋性的重要研究方向，为进一步探讨机制提供依据和线索。