HBx-c-Myc-Lin28B通路调控抑癌microRNAs促进人原发性肝细胞肝癌发生发展的机制和作用研究

Multifunctional HBx protein encoded by Hepatitis B virus alters the expression of the host protein-coding genes, thus contributing to the initiation and progression of hepatocelluar carcinoma(HCC).noncdoing microRNA is frequently deregulated in HCC.Both the miR-16 and Let-7 family are well-known tumor-suprressive microRNAs, we found that HBx suppressed their expression in vitro and vivo in our preliminary experiments.Ectopically expressed miR-16 inhibited the proliferation, clonogenicity and anchorage-independent growth of HBx-expressing HepG2 cells by arresting cells in the G1 phase and inducing apoptosis; We also found that HBx-c-Myc-Lin28B pathway was responsible for the downregulation of miR-16 and Let-7, while there was aslo a double-negative feedback between antecedent pathway and Let-7. This study is aimed to validate the reverse relationship between HBx and miR-16 and/or Let-7 in HCC samples, and to investigate the clinical significance of HBx-c-Myc-Lin28B pathway and associated microRNAs in hepatocarcinogenesis. Our study may highlight the therapeutic roles that targeting HBx-c-Myc-Lin28B pathway and deregulated microRNAs in HCC.

乙肝病毒编码的多功能蛋白HBx能调控人肝细胞内蛋白编码基因表达而促进肝癌发生发展，非蛋白编码的microRNA异常表达也常见于肝癌。 miR-16及Let-7家族均为经典抑癌microRNAs，我们在前期研究中发现HBx在体内外导致人肝癌细胞内miR-16及Let-7家族成员低表达。外源表达的miR-16能通过阻滞细胞周期进展和诱导凋亡而抑制HBx阳性肝癌细胞的增殖、克隆形成及非贴壁生长能力；初步证实人肝癌细胞内存在HBx-c-Myc-Lin28B 通路，该通路导致miR-16和Let-7低表达且可能与Let-7之间存在双向负反馈环路。 本研究将进一步在肝癌及癌旁组织中验证HBx和miR-16/Let-7的表达关系，在体内和体外深入探讨HBx-c-Myc-Lin28B通路调控相关microRNAs在肝癌发生发展中的临床意义,为肝癌治疗提供新思路。

人乙肝病毒编码的癌蛋白HBx能通过调控宿主细胞遗传学和表观遗传学而参与肝癌的起始和发生。表观遗传学包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA和染色质重塑。本研究将HBx的调控功能从蛋白编码基因拓展到非编码RNA领域包括miRNA和lncRNA（长链非编码RNA），并将二者与DNA甲基化联系起来。我们发现HBx不仅能在肝癌细胞内导致miRNA和lncRNA表达谱异常改变，还能诱发宿主细胞内DNMTs异常表达且三者之间存在相互作用。进一步研究分为三部分包括(1) HBx在肝癌中通过上调Lin28B而沉默Let-7：qRT-PCR和western-blot证实肝癌细胞和组织中“癌胚基因”Lin28B显著高表达，其介导了HBx对肝癌细胞中Let-7的抑制作用。靶向沉默Lin28B可通过阻滞细胞周期进展而抑制HBx阳性细胞的增殖。(2) HBx通过上调DNMTs诱导肝癌细胞和组织中miR-338启动子甲基化而表达下调：HBx稳定表达和去甲基化药物处理前后HepG2细胞miRNA表达芯片交集发现miR-338在HBx阳性的HepG2肝癌细胞内可能因甲基化而沉默。qRT-PCR进一步证实了miR-338-3p/5p低表达于大部分肝癌细胞株和肝癌组织且存在HBx相关。MassArray 甲基化检测发现肿瘤组织中miR-338基因启动子的两个CPG岛甲基化率均显著高于癌旁组织。(3) HBx-WEE2-AS1-FERMT3通路促进肝癌进展：WEE2-AS1（WEE2的反义lncRNA）在肝癌细胞和组织中显著高表达且存在HBx/HBV相关性，它不仅能预测患者生存预后，还能在体外激活PI3K-Akt通路进而促进肝癌细胞进一步恶性转化。mRNA表达芯片和生物信息学工具分析发现FERMT3 (Fermitin family homolog 3) 是WEE2-AS1下游的重要效应分子，其同样在HBx/HBV阳性肝癌细胞和组织中高表达。WEE2-AS1能在体外抑制肝癌细胞凋亡、促进肝癌细胞增殖、细胞周期进展、细胞迁移和侵袭。WEE2-AS1可能与miR-214结合并抑制其对FERMT3的沉默。前期miRNA芯片结果证实HBx可在HepG2细胞中下调miR-214>3倍。综上，我们的研究丰富了HBx相关表观遗传学改变，并将DNA甲基化和非编码RNA联系起来，证实二者可相互作用和促进。